HIF-1α在丹參酮ⅡA減輕內毒素性急性肺損傷中的作用及其機制研究.pdf

1、研究背景：
　　急性肺損傷（acute lung injury，ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是由于創(chuàng)傷、燒傷或敗血癥等因素引起的以急性、進行性非心源性呼吸衰竭為特征的疾病，是臨床上常見的難治性危重癥，具有較高的死亡率。盡管醫(yī)務工作者做了大量的相關工作，但到目前為止，尚缺乏治療ALI特異有效的方法。
　　脂多糖（lipopolysacchari

2、de，LPS）是ALI的常見致病因素之一。許多研究證明，LPS能結合于單核/巨噬細胞表面的CD14受體，并促進細胞產生大量的細胞因子與炎性介質。近年來，缺氧誘導因子1α（hypoxia-induciblefactor1α，HIF-1α）被認為在LPS誘導的炎癥反應的發(fā)生發(fā)展過程中起了重要作用。文獻表明，LPS能誘導多種細胞表達HIF-1α，尤其是單核細胞和巨噬細胞。與缺氧和其他刺激不同的是，LPS通過增加HIF-1α的mRNA水平，促進

3、蛋白翻譯，并抑制其降解來誘導HIF-1α表達的增加。研究進一步表明，HIF-1α在髓樣細胞介導的炎癥與LPS通過TOLL樣受體4（toll like receptor 4，TLR4）誘導的敗血癥中起了非常重要的作用。同時，HIF-1α也參與了皮膚和關節(jié)中巨噬細胞的炎癥反應，并能促進巨噬細胞的吞噬功能。因此，限制巨噬細胞內HIF-1α介導的炎癥反應可能有益于減輕炎癥相關的組織損傷。
　　丹參酮IIA（tanshinone IIA，T

4、IIA）是唇形科植物丹參中的脂溶性活性成分之一，大量文獻報道TIIA具有抑制炎性介質與氧自由基釋放的作用。我們以前的實驗表明TIIA能顯著降低LPS導致的小鼠的死亡率，并能減輕在體和離體實驗中LPS導致的肺損傷。但是，目前尚不清楚TIIA是如何減輕LPS性肺損傷的。本實驗擬觀察TIIA對內毒素血癥時炎癥反應的影響，研究TIIA對LPS性肺損傷的保護作用是否與HIF-1α有關，并進一步探索TIIA是如何調節(jié)HIF-1α的表達。
　　

5、實驗目的：
　　（1）觀察TIIA對內毒素性肺損傷時炎癥反應的作用；
　?。?）研究LPS誘導巨噬細胞中HIF-1α表達的作用；
　?。?）研究TIIA對LPS誘導的HIF-1α表達的抑制作用；
　?。?）探索TIIA抑制LPS誘導的HIF-1α表達的作用機制。
　　實驗方法：
　　動物實驗
　　雄性BALB/c小鼠（18-22g）適應環(huán)境后，腹腔注射LPS建立小鼠肺損傷模型，隨機分為四組：1）

6、生理鹽水（NS）對照組（n=8），給小鼠注射兩次NS，時間間隔為0.5小時；2）TIIA對照組（n=8），先給小鼠注射TIIA，0.5小時后注射生理鹽水；3）LPS組（n=8），先給小鼠注射NS，0.5小時后注射LPS；4）TIIA/LPS組（n=8）,先給小鼠注射TIIA，0.5小時后注射LPS。在各組，腹腔注射NS、TIIA（10mg/kg）和LPS（10mg/kg）。在第二次注射后6小時取肺進行病理觀察，或進行支氣管肺泡灌洗液（b

7、ronchoalveolar lavage fluid，BALF）灌洗，觀察BALF中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase,LDH）的含量、總細胞與中性粒細胞的數(shù)目，檢測血清與BALF中腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白介素（inter leukin，IL）-1β、IL-6的含量，以及Western blotting檢測小鼠肺組織中HIF-1α的含量。
　　細胞實驗：

8、
　　為了觀察LPS對HIF-1α表達的誘導作用，指數(shù)生長期的NR8383與RAW264.7巨噬細胞被血清饑餓16-20小時后，用不同濃度的LPS（0.5-10μg/ml）刺激0-8小時，或用LPS（1μg/ml）刺激6小時，Westernblotting檢測HIF-1α的表達。
　　為了研究TIIA對LPS誘導的炎癥因子釋放、HIF-1α表達的作用及其相關機制，指數(shù)生長期的NR8383與RAW264.7巨噬細胞被血清饑餓1

9、6-20小時后，用0-20μg/ml的TIIA預處理細胞0.5小時后，LPS（1μg/ml）刺激6-12小時，取細胞上清測定炎癥因子的含量，或收集細胞提蛋白進行Westernblotting檢測相關蛋白的變化。
　　為了觀察HIF-1α在炎癥反應中的作用，將HIF-1αsiRNA轉染于RAW264.7細胞。轉染后細胞被LPS（1μg/ml）刺激12小時，觀察細胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1β與IL-6的變化。
　　實驗結果：

10、
　　（1）TIIA預處理改善LPS導致的肺損傷
　　腹腔注射LPS明顯增加BALF中的LDH的含量（P<0.01），說明LPS導致了小鼠急性肺損傷。但是，TIIA預處理顯著地抑制了LDH含量的增加（P<0.05），即TIIA能夠減輕LPS導致的肺損傷。
　　形態(tài)學觀察表明LPS組中肺組織明顯充血、水腫并有大量炎性細胞的浸潤，而在TIIA/LPS組內毒素所致的肺損傷明顯減輕，肺組織結構趨于正常。
　?。?）TII

11、A預處理減輕LPS導致的炎癥反應
　　LPS能夠顯著增加BALF中總細胞與中性粒細胞的數(shù)目（P<0.01），但TIIA預處理顯著地抑制了上述指標的增加（P<0.05），說明TIIA能夠減輕LPS導致的炎性細胞浸潤。
　　在正常小鼠的血清與BALF中，TNF-α、IL-1β與IL-6的含量極低；但這些炎癥因子在LPS組明顯增加（P<0.01）。在TIIA/LPS組，上述炎癥因子的含量較LPS組明顯降低（P<0.05）。

12、　　同時，在RAW264.7巨噬細胞上清液中，TNFα、IL-1β與IL-6的含量在LPS組均較對照組明顯升高（P<0.05；P<0.01），但TIIA預處理濃度依賴性地降低了這些炎癥因子的含量（P<0.05；P<0.01）。
　?。?）HIF-1α在LPS誘導的炎癥反應中的作用
　　LPS（0.5-10μg/ml）刺激NR8383與RAW264.7巨噬細胞6小時后，HIF-1α的表達增加，并且這種誘導作用是LPS濃度依賴性

13、的。用LPS（1μg/ml）刺激兩種巨噬細胞0-8小時，HIF-1α的表達在LPS刺激2小時后增加，在6-8小時達高峰。
　　將HIF-1αsiRNA轉染于RAW264.7細胞，可顯著降低LPS刺激RAW264.7細胞時TNF-α、IL-1β與IL-6的分泌量（P<0.05），提示HIF-1α參與了LPS誘導的炎癥反應。
　?。?）TIIA抑制LPS誘導的HIF-1α的表達
　　同對炎癥因子的抑制效果相似，在NR838

14、3與RAW264.7巨噬細胞中，不同濃度TIIA預處理（0-20μg/ml）可以濃度依賴性地抑制LPS誘導的HIF-1α表達的增加。同時，TIIA（10mg/kg）也顯著地抑制了內毒素性小鼠肺組織中HIF-1α的表達。
　?。?）TIIA預處理對LPS刺激時HIF-1αmRNA的表達沒有作用
　　Real-timePCR結果表明，LPS明顯增加NR8383與RAW264.7巨噬細胞中HIF-1α的mRNA水平（P<0.05）

15、，但是TIIA預處理（10μg/ml）對LPS導致的HIF-1α的mRNA水平沒有明顯作用。
　?。?）TIIA預處理抑制LPS刺激時HIF-1α的蛋白翻譯
　　Westernblotting結果表明，在NR8383與RAW264.7巨噬細胞中，LPS明顯活化了AKT與MAPK通路，但是TIIA預處理（0-20μg/ml）可以濃度依賴性地逆轉上述通路的活化。
　　同時，LPS導致了p70S6K1、S6核糖體蛋白、4E-

16、BP1和eIF4E的磷酸化，但是TIIA預處理（0-20μg/ml）可以濃度依賴性的逆轉上述蛋白的活化。
　?。?）TIIA預處理通過蛋白酶體途徑促進LPS刺激時HIF-1α的蛋白降解
　　Westernblotting結果表明，在CHX存在的情況下，在LPS刺激的NR8383與RAW264.7巨噬細胞中，HIF-1α的半衰期分別為8.5分鐘與9分鐘。TIIA預處理（10μg/ml）后，HIF-1α的半衰期分別降到了4.9分

17、鐘與5分鐘。
　　TIIA預處理（10μg/ml）明顯地抑制LPS刺激時NR8383與RAW264.7巨噬細胞中HIF-1α的表達。但是在蛋白酶體MG132存在的情況下，TIIA的這種抑制作用被取消了。
　　結論：
　?。?）TIIA能抑制內毒素性肺損傷時的炎癥反應并能改善小鼠ALI。
　?。?）TIIA改善LPS性肺損傷的作用與其抑制HIF-1α的表達有關。
　?。?）TIIA對LPS誘導的HIF-1αm