萊菔硫烷對(duì)內(nèi)毒素性急性肝損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:內(nèi)毒素，即脂多糖(LPS)，是所有革蘭陰性桿菌的細(xì)胞外膜成分，是引起膿毒血癥及全身炎癥反應(yīng)綜合征的主要因素，嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染、肝病以及眾多危重疾病在其發(fā)生發(fā)展過程中多可以發(fā)生內(nèi)毒素血癥(endotoxemia)。內(nèi)毒素血癥也可導(dǎo)致多器官功能衰竭，肝臟是最容易受損的器官之一，兩者之間存在互為因果、相互影響的關(guān)系，一旦發(fā)生容易形成惡性循環(huán)。因此，阻斷該循環(huán)中的某些鏈條，阻止內(nèi)毒素對(duì)肝臟的進(jìn)一步損害，是亟待解決的關(guān)鍵問題，但迄今為止，臨床

2、尚缺乏特殊、有效的手段治療內(nèi)毒素引起的肝損傷。 目前臨床治療內(nèi)毒素急性肝損傷通常用藥物治療，常用藥物如下：①地塞米松：可能與其抑制一氧化氮(NO)過量產(chǎn)生，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，增加組織抗氧化活性有關(guān)；②血小板活化因子受體拮抗劑：可能與抗膜磷脂的降解作用及抑制氧自由基的產(chǎn)生；③甘氨酸：抑制枯否細(xì)胞的分泌功能，使腫瘤壞死因子-α(TNF-α)分泌減少，抑制腸道肥大細(xì)胞脫顆粒，組胺釋放減少，腸道壁通透性降低，從而使腸源性內(nèi)毒素入血減少

3、，血漿內(nèi)毒素水平下降；④LPS拮抗劑：可以降低LPS的生物活性，加快其通過紅細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的CRI受體的清除率；也有實(shí)驗(yàn)證明，抗LPS單抗對(duì)動(dòng)物的保護(hù)作用并不直接通過降低TNF-α，而是降低血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)TNF-α的敏感性，以及減少其他細(xì)胞因子活性，如IL-6等。⑤中藥：如解毒護(hù)肝沖劑、茵陳湯，機(jī)制尚不十分明確。目前的治療方面存在著明顯的缺點(diǎn)，如地塞米松：副作用大，特別是可致免疫功能下降，使機(jī)體清除感染的能力降低，易致感染擴(kuò)散，有進(jìn)一

4、步加重內(nèi)毒素血癥可能；LPS拮抗劑：價(jià)格昂貴，不能阻斷肝病的進(jìn)一步發(fā)展；目前治療措施機(jī)制比較單一，大多忽略膽紅素升高造成繼發(fā)肝損傷，而且未涉及自身免疫調(diào)控，綜合治療力度明顯不足。特別是采取多種藥物聯(lián)合使用，勢(shì)必會(huì)增加肝臟負(fù)荷，增加病人經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。 萊菔硫烷(SFN)是十字花科植物中含有的一種異硫氰酸鹽，自1992年被發(fā)現(xiàn)具有化學(xué)保護(hù)作用以來，逐漸正成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。研究表明，SFN具有抑制I相酶、誘導(dǎo)Ⅱ相酶，具有抗氧化損傷的作

5、用；能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分裂周期停滯和凋亡，能抑制腫瘤血管上皮細(xì)胞，具有抗腫瘤作用；能SFN能提高自然殺傷細(xì)胞活性，增強(qiáng)吞噬細(xì)胞吞噬力，降低了由內(nèi)毒素刺激的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α水平，具有免疫調(diào)節(jié)的作用；能制幽門螺旋桿菌生長(zhǎng)，具有一定的抗菌作用。由于其藥物的毒副作用小，其藥理機(jī)制可以對(duì)抗內(nèi)毒素對(duì)肝臟損傷作用機(jī)制。目前國內(nèi)外尚無相關(guān)研究，本實(shí)驗(yàn)的研究旨在明確SFN對(duì)內(nèi)毒素急性肝損傷是否具有保護(hù)作用，為臨床應(yīng)用提高理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)。

6、目的：建立內(nèi)毒素急性肝損傷大鼠動(dòng)物模型，明確清內(nèi)毒素造成急性肝臟損傷的病理生理特點(diǎn)，進(jìn)一步闡明內(nèi)毒素致急性肝損傷的作用規(guī)律及機(jī)制，利用SFN干預(yù)內(nèi)毒素急性肝損傷大鼠，通過各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)明確SFN對(duì)內(nèi)毒素急性肝損傷是否具有保護(hù)作用和作用強(qiáng)度，為臨床治療提供理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)。 方法： (1)構(gòu)建亞致死量LPS致D-半乳糖胺(D-GaLN)致敏肝細(xì)胞損傷大鼠動(dòng)物模型。選擇48只健康Wistar大鼠，隨機(jī)分為三組，每組16只，

7、每組再隨機(jī)分為對(duì)照組和處理組。處理組分別腹腔注射亞致死量的內(nèi)毒素LPS(50ug/Kg)+D-GaLN(300mg/Kg)，對(duì)照組僅注射1ml無菌生理鹽，分別于6h、24h、48h經(jīng)主動(dòng)脈取大鼠全血，離心獲取血清，后分別處死取大鼠，光鏡下觀察大鼠肝臟病理，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平、總膽紅素(BIL)水平，TUNEL染色肝組織凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)；ELISA檢測(cè)血清白介素-1β(IL-1

8、β)水平，RT-PCR檢測(cè)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGT1A1)mRNA表達(dá)。 (2)SFN對(duì)內(nèi)毒素急性肝損傷的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)研究。將24只健康Wistar大鼠隨機(jī)分為三組，即對(duì)照組、DEX干預(yù)組、SFN干預(yù)組，每組8只，每組事先分別腹腔注射LPS(50ug/Kg)+D-GaLN(300mg/Kg)，DEX干預(yù)組分別腹腔注入用Dex(5mg/Kg)1ml，SFN干預(yù)組分別腹腔注入SFN1mg/K

9、g1ml，對(duì)照組僅注射1ml生理鹽水，在24h處死大鼠后再次光鏡下分析肝組織病理、用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清ALT、AST、BIL水平，TUNEL染色肝組織凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)，ELISA檢測(cè)血清IL-1β水平，RT-PCR檢測(cè)TNF-amRNA、UGT1A1mRNA的表達(dá)。 結(jié)果： 建動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中： 1.組織病理學(xué)特征： (1)對(duì)照組：肝小葉組織結(jié)構(gòu)完整，未見腫脹、變性、壞死。 (2)6h處理組：肝細(xì)

10、胞輕度濁腫，未見壞死。 (3)24h處理組：肝細(xì)胞廣泛濁腫，點(diǎn)灶狀壞死，中央靜脈擴(kuò)張充血. (4)48h處理組：肝細(xì)胞廣泛濁腫，大量點(diǎn)灶狀壞死，大量炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)。 2.血清ALT、AST、BIL水平： 注射LPS/D-GaLN6h后開始升高，處理組較對(duì)照組明顯升高，兩者有顯著差異(P＜0.01)，后隨時(shí)相改變，ALT、AST、TBIL水平逐漸上升，24h后達(dá)到高峰(ALT3204.875±791.400，

11、AST3662.500±725.661，TBIL65.100±23.150)，24h組與6h組比較有顯著差異(P＜0.05)。后維持高水平，24h組與48h組比較無顯著差異(P＞0.05)。 3.肝臟組織細(xì)胞凋亡檢測(cè)： TUNEL染色表現(xiàn)為細(xì)胞核染成棕褐色，核固縮，染色質(zhì)邊集，胞質(zhì)嗜酸性，肝臟組織細(xì)胞AI在6h升高，與對(duì)照組有顯著性差異(P＜0.01)，后隨時(shí)相改變，凋亡細(xì)胞增加明顯，24h達(dá)高峰(29.225±4.31

12、5)，24h組與6h組有顯著顯著性差異(P＜0.01)，48hAI仍維持高水平。 4.IL-1β、TNF-αmRNA、UGT1A1mRNA表達(dá)檢測(cè)結(jié)果： IL-1β在6h明顯升高，與對(duì)照組有顯著性差異(P＜0.01)，24h開始下降，48h明顯降低，與24組有顯著性差異(P＜0.01)，仍高于對(duì)照組(P＜0.01)。TNF-αmRNA在6h明顯升高，與對(duì)照組有顯著性差異(P＜0.01)，24h仍維持較高水平，48h明顯降

13、低，與對(duì)照組無顯著性差異(P＞0.05)。UGT1A1mRNA在6h明顯升高，與對(duì)照組有顯著差異(P＜0.01)，24h維持較高水平，48h開始下降，與24h組有顯著差異(P＜0.01)，與對(duì)照組無顯著性差異(P＞0.05)。 在SFN對(duì)內(nèi)毒素急性肝臟損傷保護(hù)作用的研究實(shí)驗(yàn)中： 5.組織病理學(xué)特征： (1)對(duì)照組：肝臟可小葉結(jié)構(gòu)完整，可見點(diǎn)狀壞死，可見大量炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)。 (2)DEX干預(yù)組：肝臟血管旁粘液

14、樣變，可見雙核肝細(xì)胞，同時(shí)可見點(diǎn)灶狀壞死。 (3)SFN干預(yù)組：肝細(xì)胞廣泛濁腫，未見明顯壞死，可見肝細(xì)胞增生。 6.血清ALT、AST、TBIL水平： SFN干預(yù)組與DEX干預(yù)組均能使其下降，與對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.01)，兩者比較無顯著性差異(P＞0.05)。 7.肝臟組織細(xì)胞凋亡檢測(cè)： SFN干預(yù)組與DEX干預(yù)組均能使AI下降，與對(duì)照組比較(P＜0.01)，兩者比較無顯著性差異(P＞

15、0.05)。 8.IL-1β、TNF-α、UGT1A1RNA檢測(cè)結(jié)果： 只有SFN干預(yù)組在24h能降低IL-1β的生成，DEX干預(yù)組不能降低，與對(duì)照組比較無顯著性差異(P＞0.05)；SFN干預(yù)組與DEX干預(yù)組均能降低TNF-αmRNA的表達(dá)，與對(duì)照組比較(P＜0.01)，SFN干預(yù)組降低作用更明顯，與DEX干預(yù)組比較(P＜0.01)；SFN干預(yù)組與DEX干預(yù)組均增強(qiáng)UGT1A1mRNA的表達(dá)，與對(duì)照組比較(P＜0.01

16、)，兩者間增強(qiáng)效果無顯著性差異(P＞0.05)。 結(jié)論： 1.亞致死量LPS可造成D-GaLN致敏大鼠急性肝損傷，該模型適合于對(duì)內(nèi)毒素急性肝損傷的進(jìn)一步研究。 2.細(xì)胞凋亡是內(nèi)毒素急性肝損傷重要的形態(tài)學(xué)改變，應(yīng)引起重視。 3.IL-1β、TNF-α在早期(6h)出現(xiàn)了明顯升高，因此早期干預(yù)可減少炎癥介質(zhì)對(duì)肝臟的第二次打擊。 4.內(nèi)毒素肝損傷大鼠在膽紅素代謝方面早期(6h、24h)代謝能力增強(qiáng)，晚期

17、(48h)下降，保護(hù)肝細(xì)胞，對(duì)降低高膽紅素非常重要。 5.SFN與DEX均能降低內(nèi)毒素急性肝損傷大鼠的ALT、AST水平，減少細(xì)胞凋亡，降低TNF-αmRNA的表達(dá)，增強(qiáng)UGT1A1mRNA的表達(dá)，既減少了TNF-amRNA對(duì)肝臟的二次打擊，又能降低黃疸水平，說明SFN與DEX對(duì)內(nèi)毒素急性肝損傷均有保護(hù)作用。 6.SFN能降低IL-1β水平，降低TBIL水平，在降低TNF-αmRNA表達(dá)方面比DEX作用更強(qiáng)，說明SFN比