脂氧素受體激動劑BML-111在內(nèi)毒素性急性肺損傷中促進肺泡水腫液清除的實驗研究.pdf

1、第一部分脂氧素受體激動劑BML-111在大鼠內(nèi)毒素性急性肺損傷中的保護效應(yīng)
　　 目的：建立大鼠內(nèi)毒素性急性肺損傷模型，探討脂氧素受體激動劑BML-111 對急性肺損傷的保護作用及可能機制。
　　 方法：40只清潔級雄性SD 大鼠，體重在250～350g 之間，隨機分成4組：空白對照組（C組）、脂多糖組（A組）、BML-111組（B組）和BML-111治療組（AB組）。C組經(jīng)腹腔注射PBS，半個小時后尾靜脈注入生理鹽水；

2、A組經(jīng)腹腔注射PBS，半個小時后尾靜脈注入脂多糖5mg/kg；B組BML-111 按1μg/g 經(jīng)腹腔注射，半個小時后尾靜脈注入生理鹽水；AB組BML-111（1μg/g）腹腔注射，半個小時后尾靜脈注入脂多糖5mg/kg。4組大鼠尾靜脈注入生理鹽水及脂多糖6 小時后，頸動脈放血處死。光鏡下觀察大鼠肺組織的病理學(xué)改變，進行急性肺損傷評分；測定肺組織濕干重比值（W/D）；檢測支氣管肺泡灌洗液中（BALF）的總蛋白濃度；測定肺組織的髓過氧化物

3、酶(MPO)活性、一氧化氮（NO）含量、丙二醛(MDA)濃度和超氧化物歧化酶(SOD)活力；用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法檢測肺組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α)mRNA；用凝膠電泳遷移率實驗（EMSA）檢測大鼠肺組織核轉(zhuǎn)錄因子-κB （NF-κB）的活化水平。
　　 結(jié)果：（1）空白對照組和BML-111組肺泡組織結(jié)構(gòu)沒有明顯改變，脂多糖組和BML-111治療組均表現(xiàn)為肺泡毛細(xì)血管充血，肺泡腔內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤，肺泡間

4、隔增厚。但BML-111治療組病理學(xué)改變輕于脂多糖組。與空白對照組比較，脂多糖組和BML-111治療組大鼠肺組織急性肺損傷評分明顯升高；而與脂多糖組比較，BML-111治療組大鼠肺組織急性肺損傷評分明顯降低。（2）與空白對照組比較，脂多糖組和BML-111治療組肺組織濕/干重比明顯升高；而與脂多糖組比較，BML-111治療組肺組織濕/干重比明顯降低。（3）與空白對照組比較，脂多糖組和BML-111治療組大鼠BALF中的總蛋白濃度明顯升高

5、；而與脂多糖組比較，BML-111治療組大鼠BALF中的總蛋白濃度明顯降低。（4）與空白對照組比較，脂多糖組和BML-111治療組大鼠肺組織MPO活性明顯升高；而與脂多糖組比較，BML-111治療組大鼠肺組織MPO活性明顯降低。（5）與空白對照組比較，脂多糖組和BML-111治療組大鼠肺組織NO 含量明顯升高；而與脂多糖組比較，BML-111治療組大鼠肺組織NO 含量明顯降低。（6）與空白對照組比較，脂多糖組和BML-111治療組大鼠肺

6、組織MDA的濃度明顯升高；而與脂多糖組比較，BML-111治療組大鼠肺組織MDA 濃度明顯降低。（7）與空白對照組比較，脂多糖組和BML-111治療組大鼠肺組織SOD 活力明顯降低；而與脂多糖組比較，BML-111治療組大鼠肺組織SOD 活力明顯升高。（8）與空白對照組比較，脂多糖組和BML-111治療組大鼠肺組織的TNF-αmRNA 明顯升高；而與脂多糖組比較，BML-111治療組大鼠肺組織的TNF-αmRNA 明顯降低。（9）與空白

7、對照組比較，脂多糖組和BML-111治療組大鼠肺組織NF-κB 活化水平明顯升高；而與脂多糖組比較，BML-111治療組大鼠肺組織NF-κB 活化水平明顯降低。
　　 結(jié)論：脂氧素受體激動劑BML-111 對大鼠內(nèi)毒素性急性肺損傷具有保護效應(yīng)，其機制可能與抗氧化損傷、減少炎性細(xì)胞浸潤、抑制NF-κB的活化及TNF-αmRNA的表達(dá)有關(guān)。
　　 第二部分 BML-111 對內(nèi)毒素性急性肺損傷大鼠肺泡液體的清除效應(yīng)及對鈉通道

8、α亞型表達(dá)（α-ENaC）的影響
　　 目的：探討脂氧素受體激動劑BML-111 對急性肺損傷大鼠肺泡液體的清除效應(yīng)以及對鈉水主動轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中鈉通道α亞型表達(dá)的影響。
　　 方法：40只清潔級雄性SD 大鼠，體重在250～350g 之間，隨機分成4組：空白對照組（C組）、脂多糖組（A組）、BML-111組（B組）和BML-111治療組（AB組）。C組經(jīng)腹腔注射PBS，半個小時后尾靜脈注入生理鹽水；A組經(jīng)腹腔注射PBS，半個

9、小時后尾靜脈注入脂多糖5mg/kg；B組BML-111 按1μg/g 經(jīng)腹腔注射，半個小時后尾靜脈注入生理鹽水；AB組BML-111（1μg/g）腹腔注射，半個小時后尾靜脈注入脂多糖5mg/kg。4組大鼠尾靜脈注入生理鹽水及脂多糖6 小時后，氣管切開進行氣管插管，接小動物呼吸機，行容量控制通氣。機械通氣參數(shù)如下：潮氣量10 ml/kg，呼氣末正壓3cmH2O，呼吸頻率40~60 次/min，吸入氧濃度100％。分離大鼠一側(cè)頸總動脈，插入

10、動脈導(dǎo)管，接壓力換能器，連接監(jiān)護儀，持續(xù)監(jiān)測大鼠的生命體征，并可經(jīng)此采集動脈血標(biāo)本，進行動脈血氣分析。機械通氣循環(huán)穩(wěn)定30分鐘后，進行各項目檢測。檢測大鼠平均動脈壓（MAP）、心率（HR）和血氣指標(biāo)的變化；測定大鼠肺泡液體清除率（AFC），方法如下：按 5ml/kg 抽取 FITC-Albumin 標(biāo)記的5％牛血清白蛋白灌注液，將灌注液注入大鼠的肺內(nèi)，連接呼吸機，機械通氣持續(xù)1 h后，腹主動脈橫斷處死大鼠，完整取出氣管、肺和心臟，吸出肺

11、泡液體，用酶標(biāo)儀讀取熒光標(biāo)記白蛋白的注入前后數(shù)值。按公式AFC(％)=[(Cf-Ci)/Cf]×100％，Ci 為熒光標(biāo)記白蛋白注入前數(shù)值，Cf 為熒光標(biāo)記白蛋白吸出后數(shù)值，計算出肺泡液體清除率（AFC）；觀察肺組織病理學(xué)改變及急性肺損傷評分測定；用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法檢測肺組織α-ENaC mRNA的表達(dá)水平；用免疫印跡分析（Western Blot）法檢測肺組織α-ENaC蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：（1）

12、與空白對照組比較，BML-111組大鼠MAP、HR和血氣指標(biāo)沒有顯著差異；而與空白對照組比較，脂多糖組和BML-111治療組大鼠的HR、PaCO2明顯升高，MAP、PH和PaO2 明顯降低；與脂多糖組比較，BML-111治療組大鼠HR、PaCO2 明顯降低，MAP、PH和PaO2 明顯升高。（2）與空白對照組比較，脂多糖組和BML-111治療組大鼠AFC 明顯降低，而BML-111組大鼠AFC 明顯升高；與脂多糖組比較，BML-111治

13、療組大鼠AFC 明顯升高。（3）空白對照組和BML-111組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔正常，無炎性細(xì)胞浸潤；脂多糖組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞明顯，肺組織內(nèi)大量炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡壁明顯充血、水腫；BML-111治療組大鼠肺組織有炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡壁充血、水腫程度輕于脂多糖組。與空白對照組比較，BML-111組肺損傷評分沒有顯著差異，而脂多糖組和BML-111治療組大鼠肺組織急性肺損傷評分明顯升高；與脂多糖組比較，BML-111治療組大鼠肺組織

14、急性肺損傷評分明顯降低。（4）與空白對照組比較，脂多糖組α-ENaC mRNA表達(dá)明顯降低，而BML-111組和BML-111治療組α-ENaC mRNA的表達(dá)明顯升高；BML-111組和BML-111治療組α-ENaC mRNA的表達(dá)沒有顯著差異。（5）與空白對照組比較，脂多糖組α-ENaC 蛋白表達(dá)明顯降低，而BML-111組和BML-111治療組α-ENaC 蛋白表達(dá)明顯升高；BML-111組和BML-111治療組α-ENaC 蛋

15、白表達(dá)沒有顯著差異。
　　 結(jié)論：脂氧素受體激動劑BML-111 能提高大鼠肺泡液體清除率，對內(nèi)毒素性急性肺損傷具有肺泡液體清除效應(yīng)，并且其作用可能是通過增強肺水轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中α-ENaC的表達(dá)實現(xiàn)的。
　　 第三部分 BML-111 對脂多糖誘導(dǎo)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞環(huán)磷酸腺苷（cAMP）和環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）水平的影響
　　 目的：研究脂氧素受體激動劑BML-111 對脂多糖誘導(dǎo)人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞（A549）cAMP

16、、cGMP 水平的影響。
　　 方法：體外培養(yǎng)A549人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，隨機分成4組：①空白對照組②LPS組：以1μg/ml的脂多糖刺激A549人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞③BML-111組：用1μg/ml的BML-111 處理A549人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞④BML-111+LPS組：用1μg/ml的脂多糖和1μg/ml的 BML-111 處理A549人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞。各組孵育 6 小時，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

17、(RT-PCR)法檢測α-ENaC mRNA的表達(dá)；免疫印跡分析（Western Blot）法檢測α-ENaC 蛋白的表達(dá)；放射免疫分析法測定A549人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞內(nèi)cAMP、cGMP 含量。
　　 結(jié)果：（1）與空白對照組比較，LPS組和BML-111+LPS組細(xì)胞凋亡明顯升高；與 LPS組比，BML-111+LPS組細(xì)胞凋亡明顯降低。（2）與空白對照組比較，LPS組α-ENaC mRNA的表達(dá)明顯降低，BML-111組和

18、BML-111+LPS組α-ENaC mRNA的表達(dá)明顯升高。（3）與空白對照組比較，LPS組α-ENaC 蛋白表達(dá)明顯降低，BML-111組和BML-111+LPS組α-ENaC 蛋白表達(dá)明顯升高。（4）與空白對照組比較，LPS組cAMP 水平明顯降低，而BML-111組和BML-111+LPS組cAMP 水平明顯升高。與空白對照組比較，LPS組cGMP 水平明顯升高，而BML-111組和BML-111+LPS組cGMP 水平明顯降低