月季品種‘薩蔓莎’植株再生體系的建立和根癌農桿菌介導的遺傳轉化研究.pdf

1、月季是園林中應用最廣的木本花卉之一，因其花朵美麗、四季開花、適應性廣、耐修剪能力強，在我國廣泛栽培。切花月季是世界四大切花之一，然而，月季切花的瓶插壽命相比于菊花、香石竹要短得多。近些年來，不少研究者圍繞著月季切花衰老和保鮮問題進行了廣泛的探討，但最終未能從根本上解決問題。越來越多的研究結果表明在某些切花月季品種的開花和衰老過程中，乙烯合成呈現躍變型特征，外源乙烯處理加速花朵的衰老，而乙烯合成或作用抑制劑處理有利于延長花期，這些表現與乙

2、烯躍變型切花非常相似。 本研究的主要目標是通過農桿菌介導的遺傳轉化方法導入ACC氧化酶反義基因，利用反義RNA技術，抑制月季切花的乙烯合成，從而獲得花期延長的月季植株。圍繞這一目標，本研究以類似乙烯躍變型月季品種‘薩蔓莎’為試材，首先建立了該品種的離體微繁及植株再生體系，并就基因型、外植體類型、培養(yǎng)條件和植物生長調節(jié)劑等因素對月季葉片直接再生體系和間接再生體系的影響進行了詳細的研究；然后利用GUS報告基因對影響根癌農桿菌介導月季

3、遺傳轉化的條件作了深入探索，通過優(yōu)化轉化條件，建立了月季愈傷組織遺傳轉化體系；最后在此基礎上進行ACC氧化酶反義基因的轉化，并由PCR檢測結果證明獲得了月季‘薩蔓莎’轉化的愈傷組織。本研究主要的研究結果如下： 1.建立了月季4個品種的離體微繁體系。以武漢地區(qū)市場效益較好的月季品種，包括紅色系的‘薩蔓莎’、‘紅衣主教’和黃色系的‘金獎章’、‘黃和平’為材料，建立其離體微繁體系。研究結果表明：初代接種材料的采集宜在春季的4～5月間進

4、行，此時當年生枝條開始木質化，不容易失水，且經歷了冬季低溫，病蟲害少，易于滅菌消毒；4個品種初代培養(yǎng)枝條上的腋芽在MS+0.5mg/LBA+0.004mg/LNAA+0.1mg/LGA3培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～3周后，可陸續(xù)萌發(fā)，萌芽率達70％左右；將幼芽切下后每4周一次繼代在新鮮的擴繁培養(yǎng)基上，經過一定時間的適應過程，各品種試管苗的增殖效果都表現良好，其中，品種‘金獎章’和‘黃和平’相比于‘薩蔓莎’和‘紅衣主教’需要經歷更長的適應期；繼代培養(yǎng)

5、約4周后的枝條轉入1/2MS+0.1mg/LIBA生根培養(yǎng)基中，20～30d后產生不定根；移栽成活的關鍵是生根試管苗的成熟程度，開始木質化的粗壯的試管苗移栽成活率高，約為80％，但幼嫩的試管苗因容易失水，抵抗力較差，而成活率低。2.建立了月季品種‘薩蔓莎’直接器官發(fā)生途徑的植株再生體系。分別以月季品種‘薩蔓莎’、‘紅衣主教’、‘金獎章’和‘黃和平’的小葉或復葉柄為外植體，研究了不同基因型、外植體、葉位、暗培養(yǎng)時間和植物生長調節(jié)劑對不定芽

6、分化和植株再生的影響。結果表明：基因型對植株再生有重要影響，4個品種中僅‘薩蔓莎’能產生正常不定芽并完成植株再生，另外3個品種的小葉柄基部雖能產生突起，但無法再生植株；‘薩蔓莎’在誘導培養(yǎng)基(MS+1.5mg/LTDZ+0.05mg/LNAA+10mg/LAgNO3)上黑暗培養(yǎng)8d后轉入發(fā)枝培養(yǎng)基(MS+0.5mg/LBA+0.01mg/LNAA+0.1mg/LGA3)中光下培養(yǎng)，再生效果最好；暗培養(yǎng)時間過長，易形成愈傷組織而不利于不定

7、芽的分化和植株再生；小葉外植體和復葉柄的再生率分別為51.8％和10％，而小葉的葉位對植株再生無顯著影響；植物生長調節(jié)劑中NAA的效果優(yōu)于IBA，生長素濃度升高易導致愈傷組織形成而影響植株再生。 3.建立了月季品種‘薩蔓莎’間接器官發(fā)生途徑的植株再生體系。以月季品種‘薩蔓莎’試管苗小葉為外植體，探討了愈傷組織誘導及植株再生的方法。結果表明：月季‘薩蔓莎’間接器官發(fā)生途徑的植株再生需要經歷外植體愈傷組織誘導、假珠芽的發(fā)生、可增殖愈

8、傷組織的選擇和愈傷組織的分化4個階段；高濃度的生長素有利于誘導小葉外植體產生愈傷組織，在NAA、2,4-D和pCPA這3種生長素中，以2,4-D的誘導效果最好；經7.0～10.0mg/L2,4-D光下誘導愈傷15d的小葉外植體在含1.5mg/LTDZ的MS培養(yǎng)基上光下培養(yǎng)約20d后有白色假珠芽形成；將此假珠芽分離后黑暗培養(yǎng)在含0.25mg/LNAA、1.5mg/LZT和1.0mg/LGA3的培養(yǎng)基上，在繼代的過程中產生新的假珠芽和新的愈

9、傷組織，通過持續(xù)選擇生活力高、生命力強的組織，約一年后獲得可長期繼代增殖的愈傷組織，此愈傷組織白色至淡黃色，疏松顆粒狀，活力旺盛，到目前為止已保存了16個月；愈傷組織在1.0mg/LTDZ、0.01mg/LNAA和0.1mg/LGA3的誘導下30d內分化出不定芽，在含2.0mg/LBA和0.05mg/LNAA的MS培養(yǎng)基上不定芽伸長形成正常植株。 4.建立了以愈傷組織為轉化受體的根癌農桿菌遺傳轉化體系。根據本研究建立的月季‘薩蔓

10、莎’的兩種再生體系，以小葉和愈傷組織為轉化受體進行GUS報告基因的遺傳轉化。首先測試了選擇抗生素潮霉素對小葉直接分化不定芽和愈傷組織增殖的影響，結果表明，小葉外植體對潮霉素非常敏感，發(fā)枝培養(yǎng)基中6mg/L潮霉素可完全抑制不定芽的生長，而愈傷組織由于分裂能力強，對潮霉素的忍耐性也要高得多，潮霉素濃度為70mg/L時可抑制90％的愈傷組織生長。以小葉和愈傷組織為轉化受體材料，通過評價GUS基因瞬間表達結果，詳細地探討了外植體、共培養(yǎng)時光照條

11、件、共培養(yǎng)培養(yǎng)基中鹽濃度、AS濃度、pH值、菌液濃度、侵染時間、共培養(yǎng)時間和共培養(yǎng)溫度對T-DNA轉化的影響，并優(yōu)化了轉化條件。結果表明：外植體類型是影響月季‘薩蔓莎’遺傳轉化成敗的關鍵，小葉外植體對農桿菌的浸染反應不敏感，在不同的轉化條件下，均未觀測到GUS基因瞬間表達，而愈傷組織GUS基因瞬間表達量高，表現出很強的接受外源DNA的能力，但這種能力在不同的轉化條件下也存在顯著的差異；除外植體類型外，光照條件、共培養(yǎng)培養(yǎng)基中AS濃度和鹽

12、濃度也是影響T-DNA轉化的重要因子，而侵染時間和共培養(yǎng)培養(yǎng)基pH值對轉化效率影響不大；菌液濃度、共培養(yǎng)時間和共培養(yǎng)溫度的水平在一定范圍內與GUS基因的瞬間表達量呈正比，此3因素的水平過高和過低都不利于農桿菌的轉化；將愈傷組織與OD600=0.5～0.8的菌液侵染20min，然后在黑暗、23℃條件下于含30μMAS的鹽類減半的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d可獲得最佳的T-DNA轉化效率。利用此優(yōu)化的轉化系統(tǒng)進行農桿菌的侵染，并在含70mg/L潮

13、霉素和300mg/L頭孢霉素的選擇培養(yǎng)基上進行選擇，3個月后經PCR檢測證明獲得含GUS基因的穩(wěn)定轉化的愈傷組織。 5.獲得了ACC氧化酶反義基因穩(wěn)定轉化的愈傷組織。按照優(yōu)化的遺傳轉化系統(tǒng)，利用含潮霉素選擇基因和ACO反義基因的EHA105菌株和GV3101菌株對月季‘薩蔓莎’愈傷組織進行了遺傳轉化試驗，結果表明：共培養(yǎng)期間GV3101菌株比EHA105菌株生長慢，因此共培養(yǎng)時間為5d；PCR結果證明獲得穩(wěn)定轉化的愈傷組織。