根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘草遺傳轉(zhuǎn)化體系建立.pdf

1、甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）是豆科甘草屬灌木狀草本植物，以干燥的根和根莖入藥，是我國(guó)傳統(tǒng)大宗常用藥物。野生甘草資源因過(guò)度采挖趨于枯竭，人工種植甘草成為緩解供需矛盾的主要途徑。但人工栽培甘草中藥用成分甘草苷含量通常達(dá)不到藥典規(guī)定的入藥標(biāo)準(zhǔn)，因此建立甘草高效遺傳轉(zhuǎn)化體系，研究甘草苷合成相關(guān)基因的功能及其作用機(jī)制成為甘草品質(zhì)改良研究的重要內(nèi)容。
　　本研究針對(duì)目前甘草再生體系穩(wěn)定性差，缺乏高效遺傳轉(zhuǎn)化

2、體系的現(xiàn)狀，以烏拉爾甘草為試驗(yàn)材料，對(duì)培養(yǎng)基成分和外植體類型等影響甘草離體再生的因素進(jìn)行了探討，建立了甘草高效穩(wěn)定植株再生體系。以根瘤農(nóng)桿菌EHA105為載體，介導(dǎo)甘草苷合成關(guān)鍵基因CHI轉(zhuǎn)化甘草，建立了高效根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘草遺傳轉(zhuǎn)化體系。主要研究結(jié)果如下:
　　1.三種外植體的不定芽分化能力存在很大差異。子葉不能直接分化不定芽;子葉節(jié)不定芽分化率最高為8％，平均每個(gè)分化的子葉節(jié)只能形成1-2個(gè)不定芽;而子葉節(jié)不定芽分化率高達(dá)9

3、0％，平均每個(gè)分化的去子葉胚能夠形成3-5個(gè)不定芽，不定芽數(shù)≥3的分化率可達(dá)80％，所以去子葉胚是進(jìn)行甘草離體再生及遺傳轉(zhuǎn)化的最適外植體。
　　2.盡管去子葉胚在MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L培養(yǎng)基上分化率較高，但分化過(guò)程中發(fā)生較嚴(yán)重玻璃化，降低繼代培養(yǎng)基中6-BA的濃度，無(wú)法使已玻璃化個(gè)體恢復(fù)正常。用6-BA2.0 mg/L水溶液浸泡過(guò)夜的種子制備去子葉胚，于MS+6-BA0.5mg/L培養(yǎng)基上誘導(dǎo)分化，

4、不但使去子葉胚的分化率升高，而且使玻璃化率由13％降為7％。
　　3.試管苗轉(zhuǎn)接種于生根培養(yǎng)基上后，約在第7d產(chǎn)生可見(jiàn)不定根，在MS和1/2MS+IAA0.5mg/L培養(yǎng)基上生根率分別為77％和60％，而在1/2MS培養(yǎng)基上生根率可達(dá)93％。
　　4.對(duì)甘草PPT敏感性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，根據(jù)篩選出轉(zhuǎn)化子的同時(shí)對(duì)植物的傷害最低原則，分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中適宜的PPT篩選壓分別為2.0和1.0 mg/L。
　　5.研究了侵染菌

5、濃度、侵染時(shí)間、AS濃度、共培養(yǎng)時(shí)間等因素對(duì)陽(yáng)性苗率的影響。最適宜甘草遺傳轉(zhuǎn)化的侵染菌濃度OD600=0.5，侵染時(shí)間為30 min;共培養(yǎng)基中AS最適濃度為50 mg/L，最佳共培養(yǎng)時(shí)間為4d。在這一轉(zhuǎn)化條件下，陽(yáng)性苗率高達(dá)10％。
　　6.對(duì)抑菌劑Cef的使用濃度進(jìn)行了選擇，當(dāng)分化培養(yǎng)基中Cef濃度為300mg/L，去子葉胚的存活率達(dá)83％;生根培養(yǎng)基中Cef為200 mg/L時(shí)，試管苗污染率為0，生根率為90％。所以分化和生