黃瓜再生體系的建立及農桿菌介導的遺傳轉化.pdf

1、黃瓜（Cucumis sativus L.）是我國設施和露地主要栽培的蔬菜作物之一，生產中黃瓜經常受到干旱、鹽堿、病蟲等因素的脅迫，嚴重影響了黃瓜的品質和產量。通過工程手段改良黃瓜現有品種，把育種技術從宏觀水平提高到微觀水平，為品種改良提供了一條全新途徑。運用生物工程技術培育高產、高抗、多抗、優(yōu)良的黃瓜新品種已經成為黃瓜育種工作的發(fā)展方向，為今后持續(xù)培育新品種和大幅度的改良現有品種提供了科學的手段和途徑。高效的黃瓜再生和轉化體系是黃瓜轉

2、基因育種的基礎，因此，進一步研究影響黃瓜再生和轉化的各種因素，優(yōu)化黃瓜再生和轉化體系具有重要的理論和實踐意義。
　　 本課題在前人研究基礎上，從外植體類型、外源植物激素、外植體切割及接種方式、外植體苗齡、內源激素變化等方面進一步研究影響黃瓜再生的各種因素，建立了完整的黃瓜子葉節(jié)高效再生體系，并在此基礎上通過Kan選擇壓試驗建立了農桿菌介導的黃瓜子葉節(jié)遺傳轉化體系，將黃瓜反義 cuPLDα基因轉入黃瓜體內。取得主要結果如下：

3、>　　 1．子葉節(jié)是黃瓜離體再生的最佳外植體，子葉節(jié)離體再生受外源植物激素、外植體切割及接種方式、外植體苗齡苗態(tài)等因素的影響。MS 添加1.5 mg/L BA是誘導子葉節(jié)產生不定芽的最佳培養(yǎng)基；切除子葉部分的1/3，切除葉緣平鋪是子葉節(jié)組織培養(yǎng)的最佳切割和接種方式；6-7 d苗齡、兩片子葉張開呈豎直狀態(tài)的無菌苗有較高的再生頻率且便于操作；MS培養(yǎng)基是誘導不定芽生根的最佳培養(yǎng)基；從子葉節(jié)接種開始至再生植株移栽入土為止整個再生過程約需50

4、 d。
　　 2．子葉節(jié)離體培養(yǎng)培養(yǎng) 0 d時，ABA 含量最高，IAA和 GA 含量最低；愈傷組織誘導期（3-9 d），ABA、IAA、GA和ZR含量先升高后降低；愈傷組織分化期（9-15 d），IAA和 GA 含量均先升高后降低，ZR 含量一直降低，而ABA含量則先降低后升高。這表明內源激素對黃瓜子葉節(jié)再生過程中的生理狀態(tài)有著極其重要的影響，隨著黃瓜子葉節(jié)再生階段的變化，內源激素含量也呈現不同變化，其種類、含量及協(xié)調平衡是愈

5、傷組織形成和不定芽分化的關鍵。
　　 3．以子葉節(jié)再生體系為基礎，建立農桿菌介導的黃瓜遺傳轉化體系，主要包括：預培養(yǎng)、侵染及共培養(yǎng)、選擇及分化培養(yǎng)、生根培養(yǎng)等步驟。Kan 選擇壓 150 mg/L可以抑制非轉化植株不定芽的產生，濃度為 250 mg/L Cb能夠有效抑制農桿菌的生長。對 250個子葉節(jié)外植體的遺傳轉化試驗得到 20個抗性芽叢，PCR鑒定結果顯示有 12個株系呈陽性，轉化率為 4.8 ％。RT-PCR 檢測結果顯示