副豬嗜血桿菌lgtB和lex-1基因在脂寡糖合成及致病過程中的作用.pdf

1、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS）是定植于豬上呼吸道的條件性致病菌，臨床上常引起以多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎等為特征的格拉瑟氏?。℅l?sser’s disease）。由于HPS血清型眾多，不同血清型間毒力差異很大，缺乏免疫交叉性，所以至今為止還沒有很好的防控副豬嗜血桿菌病的方法。目前國內(nèi)外學(xué)者對(duì)HPS致病相關(guān)因子進(jìn)行了諸多研究，發(fā)現(xiàn)脂寡糖是潛在的毒力因子之一，可以介導(dǎo)HPS的粘附作用和誘導(dǎo)細(xì)胞釋放炎性介

2、質(zhì)。然而與脂寡糖合成相關(guān)的基因仍有待深入研究。
　　LgtB/lex-1是HPS基因組上尚待研究的兩個(gè)基因。在其他菌中已有報(bào)道lgtB/lex-1編碼β-1,4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，該酶是糖基轉(zhuǎn)移酶家族25（Glycosyltransferase family25）的成員，參與脂寡糖的合成。因此，本研究旨在分析HPS lgtB/lex-1基因在脂寡糖合成及HPS致病過程中的作用。
　　本研究首先構(gòu)建了lgtB的缺失突變載體質(zhì)粒pZ

3、Q001和lex-1的缺失突變載體質(zhì)粒pZQ002，利用自然轉(zhuǎn)化的方法將載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化親本菌株HPS SC096分別獲得了缺失 lgtB基因和 lex-1基因的重組菌ΔlgtB株和Δlex-1株；其次構(gòu)建了互補(bǔ)載體質(zhì)粒pZQ003和pZQ004，用相同的自然轉(zhuǎn)化方法獲得了ΔlgtB-c和Δlex-1-c互補(bǔ)菌株；通過PCR及測序確定菌株構(gòu)建正確。
　　為了觀察 lgtB/lex-1基因缺失后脂寡糖的變化，本研究提取了野生菌株和重組菌

4、株的脂寡糖，通過SDS-PAGE及銀染等方法進(jìn)行分析。結(jié)果顯示ΔlgtB和Δlex-1缺失株的脂寡糖的泳動(dòng)速度均明顯快于野生菌株，表明 lgtB/lex-1基因缺失后菌株的脂寡糖分子量變小，脂寡糖鏈的長度在基因缺失之后變短，說明 lgtB/lex-1基因參與脂寡糖的合成。而互補(bǔ)菌株ΔlgtB-c和Δlex-1-c的脂寡糖的泳動(dòng)速度和野生菌株一致，說明lgtB/lex-1互補(bǔ)成功。
　　本文研究了 lgtB/lex-1基因缺失后對(duì)菌

5、株抵抗補(bǔ)體介導(dǎo)的血清殺傷作用的影響。結(jié)果表明在缺失 lgtB/lex-1后 HPS的存活率由親本株的74.92％分別降至15.00%和54.46%，差異顯著，這表明兩個(gè)基因缺失后菌株對(duì)抗血清殺傷作用的能力降低；互補(bǔ)lex-1后的菌株存活率與親本株相比無顯著差異，而ΔlgtB-c互補(bǔ)菌株的存活率降為8.51%，和親本株相比下降了約10倍，差異顯著。為了探討ΔlgtB-c互補(bǔ)菌株血清敏感性升高的原因，運(yùn)用熒光定光PCR方法檢測lgtB的表達(dá)

6、量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ΔlgtB-c互補(bǔ)株中l(wèi)gtB的轉(zhuǎn)錄水平是親本株的27.05倍，說明lgtB基因在互補(bǔ)菌株中表達(dá)過量，這種對(duì)補(bǔ)體更為敏感的表型可能與lgtB過表達(dá)有關(guān)。
　　副豬嗜血桿菌致病的重要機(jī)制之一是粘附和入侵宿主細(xì)胞。因此本研究測定了ΔlgtB和Δlex-1缺失株對(duì)豬腎上皮細(xì)胞（PK-15）的粘附和入侵能力。結(jié)果表明和野生型菌株相比，ΔlgtB、Δlex-1缺失株的粘附和入侵能力都有顯著的下降，意味著lgtB/lex-1基因缺

7、失后會(huì)導(dǎo)致菌株粘附入侵宿主細(xì)胞的能力下降。
　　最后，本研究用ΔlgtB缺失株通過腹腔接種的方式感染250g左右健康普通級(jí)豚鼠，并與親本株SC096比較毒力差異。結(jié)果顯示感染SC096組豚鼠出現(xiàn)食欲、飲水量下降，精神不振，被毛粗亂、呼吸困難等臨床癥狀，但感染ΔlgtB缺失株組豚鼠無明顯臨床癥狀；感染SC096組豚鼠腹腔中有較多纖維素性滲出液，肝臟、胃，小腸表面都出現(xiàn)白色纖維素滲出，而感染ΔlgtB缺失株組豚鼠無明顯眼觀病理變化，腹