副豬嗜血桿菌感染和應(yīng)激相關(guān)基因的鑒定與功能研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,HPS)是豬的一種呼吸道共棲菌,在特定條件下可侵入機(jī)體而引起嚴(yán)重的全身性疾病,被稱為副豬嗜血桿菌病或革拉澤氏病(Gl(a)sser’s disease)。該病以多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎和肺炎為主要特征,已經(jīng)成為影響全球養(yǎng)豬業(yè)最為嚴(yán)重的細(xì)菌性傳染病之一。作為一種新發(fā)傳染病的病原,人們對(duì)其毒力相關(guān)因子和致病機(jī)理知之甚少,嚴(yán)重制約了診斷與防治技術(shù)的研究。病原菌在感染過(guò)程中,必須適應(yīng)動(dòng)

2、物機(jī)體內(nèi)溫度、pH、滲透壓、氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)等環(huán)境應(yīng)激的變化,并產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)答反應(yīng),因此,廣義的毒力相關(guān)因子應(yīng)該包括那些與體內(nèi)、外環(huán)境應(yīng)答有關(guān)的所有病因?yàn)樽印＿@些感染相關(guān)因子的鑒定與表達(dá)調(diào)控的研究,不僅有利于病原菌致病機(jī)理的解析,而且對(duì)疫苗、藥物和診斷試劑的設(shè)計(jì)與研制具有重要的指導(dǎo)意義。本研究運(yùn)用轉(zhuǎn)錄序列選擇性捕獲(Selective Captureof Transcribed Sequences,SCOTS)技術(shù)分別鑒定了HPS在感染

3、豬肺組織中、體外缺鐵和高溫條件下表達(dá)上調(diào)的基因共113個(gè),并對(duì)其中部分基因編碼的蛋白質(zhì)的免疫原性及與宿主腦組織的相互作用進(jìn)行了研究,現(xiàn)將主要研究的結(jié)果報(bào)告如下:
　　 1.副豬嗜血桿菌感染和應(yīng)激相關(guān)基因的篩選副豬嗜血桿菌在豬肺組織中上調(diào)表達(dá)基因的鑒定與功能分析:應(yīng)用SCOTS技術(shù)共鑒定到HPS0165株在感染豬肺組織中上調(diào)表達(dá)的基因38個(gè),這些基因按照功能可以分為以下5類:細(xì)胞表面蛋白3個(gè)、代謝和應(yīng)激相關(guān)蛋白24個(gè)、調(diào)節(jié)蛋白3個(gè)

4、、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4個(gè)、和未知功能蛋白4個(gè)。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)分析進(jìn)一步驗(yàn)證了SCOTS結(jié)果的可靠性,同時(shí)發(fā)現(xiàn)黏附素YadA和唾液酸合成酶SiaB兩種重要的毒力因子在HPS感染豬的多數(shù)組織中均表達(dá)。其中YadA在感染豬肺組織中表達(dá)量最高,提示它與HPS在豬肺臟的定植有關(guān)；而SiaB在感染豬腦組織中表達(dá)量最高,可能直接或者間接參與HPS突破血腦屏障和腦膜炎的發(fā)生。此外,運(yùn)用反向Southern Dot Blot技術(shù)進(jìn)一步研

5、究了上述38個(gè)HPS體內(nèi)表達(dá)基因與缺鐵、厭氧和高溫應(yīng)激之間的關(guān)系,為其表達(dá)調(diào)控及功能的深入研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 副豬嗜血桿菌缺鐵應(yīng)激基因的鑒定:運(yùn)用SCOTS技術(shù)鑒定了HPS在鐵限制條件下上調(diào)表達(dá)的基因36個(gè),分別編碼細(xì)胞表面蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和結(jié)合蛋白、與物質(zhì)代謝和能量代謝相關(guān)的酶或蛋白質(zhì)。為了驗(yàn)證SCOTS的結(jié)果,利用實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR技術(shù)有6個(gè)基因被選作轉(zhuǎn)錄水平分析驗(yàn)證。其中recN和hrpA同DNA復(fù)制與修復(fù)相關(guān),

6、ccmA和acrB同呼吸和電子傳遞鏈相關(guān),而ptnC和gmhA同糖代謝相關(guān)。結(jié)果顯示:副豬嗜血桿菌在鐵限制條件下上調(diào)表達(dá)了所有這6個(gè)基因高于33倍于正常培養(yǎng)條件。
　　 副豬嗜血桿菌在高溫條件下上調(diào)表達(dá)基因的鑒定:應(yīng)用SCOTS技術(shù)篩選到副豬嗜血桿菌在高溫條件下上調(diào)表達(dá)的基因39個(gè),并對(duì)所篩選出的基因進(jìn)行功能注釋與分類。這39個(gè)基因可以按功能上分為7類:DNA代謝,能量代謝,糖代謝,氨基酸和蛋白質(zhì)的合成,脂肪酸代謝,轉(zhuǎn)運(yùn),調(diào)節(jié)蛋

7、白和未知功能。通過(guò)SCOTS技術(shù)在高溫條件下篩選出來(lái)的HPS上調(diào)表達(dá)的基因許多都是由轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子σ32強(qiáng)調(diào)控的產(chǎn)物。
　　 2.副豬嗜血桿菌感染和應(yīng)激相關(guān)蛋白質(zhì)的免疫原性研究
　　 本研究從SCOTS技術(shù)篩選獲取得到的感染與應(yīng)激相關(guān)的基因中,依次通過(guò)生物信息學(xué)功能預(yù)測(cè),信號(hào)肽預(yù)測(cè),流式細(xì)胞術(shù)以及間接免疫熒光檢測(cè)候選抗原蛋白與豬肺上皮細(xì)胞(st.Jude porcine lung cells,SJPLC)的互作與黏附,最終

8、選用了5個(gè)候選抗原蛋白,這些抗原的基因在副豬嗜血桿菌的其他血清型中遺傳保守,有望能提供交叉保護(hù)作用。通過(guò)動(dòng)物保護(hù)力實(shí)驗(yàn),從中成功得篩選到一個(gè)較好的免疫保護(hù)性抗原四型菌毛PilA。在PilA重組蛋白對(duì)仔豬免疫保護(hù)試驗(yàn)中,從攻毒后死亡率,心臟、肺臟和腹腔的纖維素化病變情況看,PilA的重組蛋白免疫組與全菌滅活苗組免疫保護(hù)的效果幾乎相同,表明重組蛋白苗及全菌滅活苗免疫均具有一定的免疫保護(hù)效果,可以作為新型疫苗的有效成分,并將為研究HPS的致病

9、機(jī)理提供新的思路。
　　 3.副豬嗜血桿菌感染和應(yīng)激相關(guān)蛋白質(zhì)與宿主蛋白質(zhì)的相互作用研究
　　 運(yùn)用酵母雙雜交技術(shù)從豬腦組織cDNA文庫(kù)中篩選到與副豬嗜血桿菌毒力因子PilA、AcrB、SiaB相互作用的蛋白質(zhì)E2A、AP-3和C1qA。篩選前誘餌質(zhì)粒進(jìn)行了自激活檢測(cè),篩選后又進(jìn)行了回轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,同時(shí)通過(guò)pull-down體外驗(yàn)證證實(shí)這三對(duì)的確能相互結(jié)合,降低了假陽(yáng)性發(fā)生率,該結(jié)果為副豬嗜血桿菌突破血腦屏障的分子機(jī)制的研