副豬嗜血桿菌多基因位點(diǎn)分子分型研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,Hps)是豬格拉瑟氏病的病原菌,引起豬多發(fā)性漿膜炎的敗血癥或以多發(fā)性漿膜炎,心包炎,關(guān)節(jié)炎以及腦膜炎。用傳統(tǒng)免疫學(xué)方法已證明副豬嗜血桿菌有15個(gè)血清型且各血清型之間無交叉保護(hù)作用。然而,用傳統(tǒng)的血清型分型方法每年有高達(dá)15-20％的野生株不能分型。為了克服這些不足,發(fā)展了基于DNA指紋圖譜的基因分型(限制性內(nèi)切酶圖譜,腸桿菌基因間保守重復(fù)序列ERIC-PCR)等研究,然而,這些分型

2、技術(shù)都是基于不同條帶大小的比對(duì),產(chǎn)生的數(shù)據(jù)很難共享,無法全面性比較,菌群之間的相互關(guān)系信息也很少,同時(shí)現(xiàn)階段我國(guó)目前尚無用于血清型和血清學(xué)研究的特異性血清和抗原。因此,用DNA測(cè)序的方法研究多基因位點(diǎn)分型,對(duì)于了解副豬嗜血桿菌的群體結(jié)構(gòu)和遺傳關(guān)系,揭示菌株的基因型與毒力之間的相關(guān)性,為革拉瑟氏病免疫預(yù)防奠定基礎(chǔ)有著重要的意義。
　　 我們采用分子生物學(xué)方法分別對(duì)副豬嗜血桿菌86個(gè)分離株的7個(gè)持家基因,包括ATP合成酶β鏈(atp

3、D)、翻譯起始因子IF-2(infB)、核糖體蛋白β亞基(rpoB)、蘋果酸脫氫酶(mdh)、6-磷酸葡萄糖脫氫酶(6pgd)、3-磷酸甘油醛脫氫酶(g3pd)和延胡索酸還原酶B(frdB)進(jìn)行了PCR擴(kuò)增；對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了測(cè)序；分析了序列類型(ST)；構(gòu)建了鄰聯(lián)(NJ)樹和系統(tǒng)進(jìn)化(UPGMA)樹,分析了菌株之間的進(jìn)化關(guān)系。主要結(jié)果如下:
　　 1.7對(duì)引物用于副豬嗜血桿菌7個(gè)持家基因的擴(kuò)增；在同一優(yōu)化的PCR反應(yīng)條件下,每個(gè)

4、菌株都擴(kuò)增出7個(gè)大小為450～600bp的條帶。
　　 2.對(duì)46個(gè)菌株的7個(gè)基因位點(diǎn)的序列進(jìn)行測(cè)序,用軟件對(duì)序列編輯、隊(duì)列比對(duì)、建立MLST定義、等位基因序列文件等,并和PUBMET公布的40株菌株7個(gè)基因位點(diǎn)的序列一起,與牛津大學(xué)動(dòng)物系Keith Jolley合作建立了副豬嗜血桿菌86個(gè)分離株的MLST數(shù)據(jù)庫,建立在國(guó)際互連網(wǎng)上的這些分離株的等位基因圖譜或序列型,構(gòu)成了可以不斷擴(kuò)展的真實(shí)分離株資料。這些資料為進(jìn)一步構(gòu)建副豬嗜

5、血桿菌分離株流行病學(xué)的全球完整圖譜和更詳細(xì)的研究該微生物的群體遺傳學(xué)提供了重要基礎(chǔ)。
　　 3.經(jīng)START2分析發(fā)現(xiàn)所研究的分離株有高度的遺傳異源性,86個(gè)菌株被分成74個(gè)序列類型?；蚱骄嚯x為0.674,IA=0.804。每個(gè)基因位點(diǎn)存在64～76不等數(shù)目的等位基因?；蛐蛄卸鄳B(tài)性位點(diǎn)最大(fedB)達(dá)325和(6pgd)219,最小(infB)為77。
　　 4.用UPGMA分析確定了5個(gè)菌群。
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