副豬嗜血桿菌和豬支氣管敗血波氏桿菌雙重PCR檢測方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，Hps)和豬支氣管敗血波氏桿菌(Bordetellabronchiseptica, Bb)是引起豬發(fā)生呼吸道綜合征(PRDC)的重要致病因子。機(jī)體在各種應(yīng)激因素的影響下或感染導(dǎo)致免疫力下降的病毒性疾病時，均易導(dǎo)致Hps和Bb的感染率大大增加。這兩種病原菌混合感染情況十分普遍，且都易引起豬呼吸道隱性感染及急、慢性炎癥，臨床癥狀相似不易區(qū)分，給臨床診斷和防治帶來困難。本研究依據(jù)Hps

2、OMP P2基因和Bb DNT基因成功建立了一種快速、簡便、精準(zhǔn)和靈敏的可同時檢測具有毒力的副豬嗜血桿菌和豬支氣管敗血波氏桿菌的診斷方法。通過試驗證實，建立的雙重PCR法特異性強(qiáng)，敏感性高，重復(fù)性好，并成功應(yīng)用于臨床實踐。
　　1.雙重PCR方法的建立
　　依據(jù)Hps OMP P2和Bb DNT基因序列各設(shè)計1對引物，并對引物進(jìn)行二聚體、同源性、互補(bǔ)性分析，試驗預(yù)計分別能擴(kuò)增出748 bp和344 bp的DNA片段。利用設(shè)計

3、的引物分別對Hps OMP P2基因和Bb DNT基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并在單一PCR基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化雙重PCR的反應(yīng)條件，包括引物濃度、退火溫度、延伸時間、dNTPs濃度、rTaq DNA polymerase濃度和鎂離子濃度的優(yōu)化。最終確立雙重PCR最佳試劑組分（25μL反應(yīng)體系）為:10×PCRBuffer(Mg2+ free)2.5μL,rTaq DNA Polymerase0.3μL,25mM MgC122μL,dNTP Mix

4、ture2μL，Hps-F和Hps-R各0.8μL，Bb-F和Bb-R各0.5μL，模板2μL，加ddH2O補(bǔ)至25μL。PCR反應(yīng)程序為:95℃預(yù)變性5min;95℃變性40 s，55℃退火50 s，72℃延伸50 s，35個循環(huán);72℃再延伸10 min，4℃保存。用建立的雙重PCR方法對各血清型Hps和Bb進(jìn)行檢測，結(jié)果毒力菌株可檢測出，而非毒力菌株不能檢測出，表明本方法適用于對具有毒力的Hps和Bb進(jìn)行快速診斷。特異試驗結(jié)果顯示

5、:本方法只能檢測出Hps和Bb，而對肺炎支原體、傳染性胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴氏桿菌、肺炎沙門氏菌、豬鏈球菌和大腸桿菌不能檢測出;敏感性試驗結(jié)果表明該方法能檢測出Hps和Bb的最低核酸濃度分別達(dá)到1.79×10-3μg/μL及8.3×10-3μg/μL;重復(fù)性試驗結(jié)果一致。說明該方法特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好。
　　2.雙重PCR方法與其他檢測方法效果比較
　　用建立的雙重PCR對來自四川部分地區(qū)的36份PRDC病料進(jìn)行

6、檢測并與單一PCR和細(xì)菌分離作比較，結(jié)果顯示，Hps和Bb的陽性檢出率分別是33.33％和5.56％。雙重PCR與細(xì)菌分離陽性符合率分別為83.33％和50％，雙重PCR與單一PCR陽性符合率達(dá)到100％。結(jié)果說明雙重PCR具有與單一PCR相同的敏感性，并且其敏感性高于細(xì)菌分離。
　　3.雙重PCR方法的臨床應(yīng)用
　　用本試驗建立的雙重PCR方法對來自四川部分地區(qū)的120份PRDC病料進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果顯示，肺組織是Hps和

7、Bb檢出率最高的部位;感染Hps的病料有38份，感染Bb的病料有17份，統(tǒng)計出Hps和Bb的陽性檢出率分別是31.67％、14.17％。5份檢出為Hps和Bb的混合感染，混合感染率為4.17％;本方法同樣適用于對菌落和組織樣品的檢測。本研究通過分別對不同地區(qū)、不同季節(jié)、不同日齡Hps和Bb的感染情況進(jìn)行統(tǒng)計和分析，從不同地區(qū)感染情況來看，Hps在四川地區(qū)已普遍存在，Bb呈散在性分布，并且兩種病原菌在四川地區(qū)均形成一定的流行趨勢，從不同季