副豬嗜血桿菌滅活疫苗的研制.pdf

1、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，HPs)是豬Glasser’S病的病原體，豬上呼吸道的一種共棲茵，它可在特定條件下侵入機(jī)體而引起以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征的全身性疾病。HPs隸屬于巴氏德桿菌科(Pastteurellaceae Pohl，1981)嗜血桿菌屬(Haemophilus winslow et al.，1917)。HPs是一種非溶血性、非運(yùn)動(dòng)性、NAD依賴型、革蘭氏陰性細(xì)小桿菌。目前，

2、我國(guó)很多省市患病豬群中均可分離獲得副豬嗜血桿菌，該菌已成為保育豬死亡的主要原因之一，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，但尚無有效的預(yù)防和控制措施。本文從副豬嗜血桿菌分離株ZJ0402生物學(xué)特性的研究及菌株毒力的測(cè)定、副豬嗜血桿菌間接ELISA抗體檢測(cè)方法的建立及副豬嗜血桿菌滅活疫苗仔豬免疫保護(hù)效力三個(gè)方面進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。結(jié)果如下： 1．副豬嗜血桿菌分離株ZJ0402生物學(xué)特性研究：本研究對(duì)本實(shí)驗(yàn)室分離的HPs分離株ZJ0402

3、的培養(yǎng)特性、生化特性、對(duì)化學(xué)消毒劑的敏感性、滅活方法及保存方法進(jìn)行了研究。結(jié)果為：(1)該分離菌株培養(yǎng)過程中最適輔酶補(bǔ)充量為0.002％、最適培養(yǎng)時(shí)間為10h； (2)1～9代菌株的生化特性為發(fā)酵木糖、山梨醇，尿素、鳥氨酸脫羧酶試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性； (3)1：10000稀釋的苯扎溴銨和1：3000稀釋的過氧乙酸可有效殺滅該菌，而1：40稀釋的復(fù)方次氯酸鈉和1：800稀釋的藍(lán)光消毒劑滅菌效果較差； (4)通過菌體滅活試驗(yàn)確定0.2％甲醛

4、作為最佳的滅活劑濃度，最佳滅活條件為37℃滅活14h； (5)保存方法：HPs于20％甘油中，置-20℃可保存2個(gè)月，置-50℃可保存4個(gè)月，凍干后置于-50℃冰箱至少可保存一年，為研制副豬嗜血桿菌滅活疫苗奠定了重要基礎(chǔ)。 2．副豬嗜血桿菌分離株ZJ0402毒力的測(cè)定：以不同劑量的副豬嗜血桿菌分離株通過鼻腔接種的方式感染斷奶仔豬，攻毒劑量分別為1.03×10<'9>CFU／頭、1.03×10<'7>CFU／頭和1.03×10<

5、'5>CFU／頭，攻毒后觀察10天，每天觀察臨床癥狀，剖檢瀕死及病癥嚴(yán)重豬、分離細(xì)菌并觀察病理變化，計(jì)算日增重確定各攻毒劑量對(duì)仔豬生長(zhǎng)狀況的影響。結(jié)果，通過鼻腔接種1.03×10<'9>CFU／頭和1.03×10<'7>CFU／頭HPs都可以引起仔豬格氏病(Glasser′S disease)，其中攻毒劑量為1.03×10<'9>CFU／頭可引起仔豬Glasser′s的典型臨床癥狀和病理變化。結(jié)果表明，1.03×10<'7>CFU/頭可

6、作為仔豬對(duì)HPs的最小感染劑量，并作為免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)中攻毒劑量的參考依據(jù)。3．副豬嗜血桿菌間接ELISA抗體檢測(cè)方法的建立：采用福爾馬林滅活的副豬嗜血桿菌全菌體作為包被抗原，建立了檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法。經(jīng)試驗(yàn)確定副豬嗜血桿菌全菌體的最佳包被濃度為2.24×10<'7>CFu/孔，待檢血清最佳稀釋度為1∶200稀釋，以及間接ELISA的最佳反應(yīng)條件。將該方法應(yīng)用于臨床，14個(gè)發(fā)病豬場(chǎng)100份血清檢測(cè)結(jié)果HPs抗體陽(yáng)性

7、檢出率為94％，明顯高于細(xì)菌分離鑒定檢測(cè)結(jié)果。并通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)該方法具有很高的特異性和重復(fù)性。4．副豬嗜血桿菌滅活疫苗仔豬免疫保護(hù)效力研究：以副豬嗜血桿菌分離菌株菌液用甲醛滅活后制成油乳劑滅活疫苗，用含不同菌數(shù)的副豬嗜血桿菌油乳劑滅活疫苗免疫斷奶仔豬，首次免疫后3周以同樣劑量和途徑加強(qiáng)免疫1次，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組，第2次免疫后2周由鼻腔途徑攻毒，通過ELISA抗體檢測(cè)、臨床癥狀觀察、病理剖檢評(píng)價(jià)該疫苗免疫效果。結(jié)果為，仔豬免疫該苗后無異常

8、臨床表現(xiàn)。以8.76×10<，8>。CFU/頭免疫劑量首次免疫后第7天即可檢測(cè)到ELISA抗體，首免后35天ELISA抗體水平達(dá)高峰，首免后5周可有效保護(hù)免疫豬免受同源副豬嗜血桿菌菌株攻毒發(fā)病。結(jié)果表明，該疫苗具有良好的安全性和保護(hù)效力。本研究成功建立了副豬嗜血桿菌間接ELISA抗體檢測(cè)方法，具有較高的特異性和重復(fù)性；確定了該株副豬嗜血桿菌菌種標(biāo)準(zhǔn)；通過免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)證實(shí)了該研究中制備的副豬嗜血桿菌滅活疫苗具有較好的保護(hù)效果，從而為該