副豬嗜血桿菌基因組學(xué)及毒力相關(guān)因子研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,HPS)是定殖在豬上呼吸道中的常在菌群組成之一,同時(shí)也是引起豬Glasser氏病的病原體,該病在臨床上以多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為主要特征。
　　 目前,世界各主要養(yǎng)豬國(guó)家和地區(qū)都有關(guān)于該病流行和暴發(fā)的報(bào)道。隨著養(yǎng)殖管理方式的轉(zhuǎn)變,這些包括早期斷奶技術(shù)的廣泛推廣使用和建立無(wú)特定病原體豬群等,使HPS成為影響當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)最重要的細(xì)菌性病原的因?yàn)橹弧Ｓ捎讷F醫(yī)臨床上表型差異菌

2、株廣泛存在,尤其是對(duì)不同毒力表型菌株差異的本質(zhì)認(rèn)識(shí)不足,關(guān)于HPS毒力相關(guān)因子,HPS感染宿主過(guò)程中如何發(fā)揮致病作用以及病原宿主相互作用的分子基礎(chǔ)等知之甚少。因此,迫切需要破譯副豬嗜血桿菌的全套遺傳物質(zhì),為進(jìn)行副豬嗜血桿菌功能基因研究開(kāi)辟道路。以本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定的副豬嗜血桿菌為主要研究材料,以我國(guó)流行的優(yōu)勢(shì)血清5型菌株SH0165為親本株,通過(guò)對(duì)其完成全基因組測(cè)序,系統(tǒng)分析了副豬嗜血桿菌的毒力相關(guān)基因組成、體內(nèi)感染過(guò)程中應(yīng)激基因變化規(guī)律

3、以及可能毒力表型遺傳演化規(guī)律。具體工作如下:
　　 1.副豬嗜血桿菌基因分型及基因組測(cè)序菌株篩選
　　 為了篩選副豬嗜血桿菌測(cè)序菌株,從我國(guó)不同地區(qū)分離鑒定的副豬嗜血桿菌菌株中選取具有代表性的17株,與17株國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)血清型參考菌株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析,利用18個(gè)保守基因的串聯(lián)序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)生樹(shù),結(jié)果表明副豬嗜血桿菌菌群至少可以分為2個(gè)基因型,我國(guó)的流行菌株大多屬于基因A型中,同時(shí)分析鑒定了兩個(gè)潛在區(qū)分強(qiáng)弱毒力菌株的分子靶

4、標(biāo)-ompP2和sodA基因。從基因A型中挑選生物學(xué)背景清楚的我國(guó)流行血清5型SH0165菌株作為副豬嗜血桿菌全基因組測(cè)序的強(qiáng)毒株。
　　 2.副豬嗜血桿菌SH0165菌株的全基因組測(cè)序分析
　　 通過(guò)“鳥(niǎo)槍法”測(cè)序策略,利用20,102條測(cè)序reads先后三輪拼接完成第一株副豬嗜血桿菌全基因組,之后通過(guò)酶切和long PCR方法確證SH0165基因組框架的正確性。全基因組分析結(jié)果表明SH0165基因組由2,269,15

5、6個(gè)核苷酸組成一個(gè)環(huán)狀染色體,G+C％含量為39.99％,編碼2299個(gè)基因。在SH0165基因組進(jìn)行基因注釋的基礎(chǔ)上,系統(tǒng)的對(duì)基因的功能分類(lèi)、編碼蛋白特征、代謝途徑中基因組成、噬菌體相關(guān)基因、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因、假基因以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控相關(guān)基因進(jìn)行分析總結(jié)。
　　 3.副豬嗜血桿菌SH0165菌株潛在毒力因子分析
　　 利用8株已完成嗜血桿菌屬全基因組序列,通過(guò)比較不同菌種菌株的毒力因子進(jìn)行同源分析,同時(shí)參考Pubmed數(shù)據(jù)

6、庫(kù)中嗜血桿菌屬毒力基因的研究文獻(xiàn),第一次系統(tǒng)總結(jié)副豬嗜血桿菌不同功能分類(lèi)的毒力相關(guān)基因。通過(guò)SH0165基因組預(yù)測(cè)的全套毒力相關(guān)基因在體內(nèi)感染以及體外模擬感染條件下差異表達(dá)基因規(guī)律的分析,總結(jié)出18個(gè)主要的毒力相關(guān)基因或操縱子基因,并通過(guò)PCR篩查分析發(fā)現(xiàn),以上18個(gè)毒力相關(guān)基因或操縱子基因在我國(guó)流行菌株中高度保守,推測(cè)這些毒力因子可能是毒力菌株發(fā)揮致病作用的關(guān)鍵因子。
　　 4.副豬嗜血桿菌SH0165體內(nèi)感染應(yīng)激基因分析

7、r>　　 利用新一代測(cè)序技術(shù)--Illumina Solexa,對(duì)體內(nèi)感染條件下(腦組織和肺組織中)副豬嗜血桿菌轉(zhuǎn)錄組分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在腦組織中特異性的有2個(gè)的噬菌體島的相關(guān)基因表達(dá)顯著上調(diào),并推測(cè)噬菌體攜帶的基因可能是副豬嗜血桿菌參與腦組織感染的效應(yīng)因子。兩種情況下共同誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的基因一共305個(gè),這些基因主要參與核苷酸生物合成、能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化途徑以及抗氧化相關(guān),推測(cè)感染過(guò)程中副豬嗜血桿菌通過(guò)提高自身合成與能量代謝效率實(shí)現(xiàn)增殖,同時(shí)

8、通過(guò)操控自身抗氧化基因的上調(diào)表達(dá)逃逸宿主氧化危機(jī)。提示核苷酸生物合成以及能量合成與轉(zhuǎn)化途徑中的關(guān)鍵酶類(lèi)具有開(kāi)發(fā)成為抗副豬嗜血桿菌感染靶標(biāo)的潛力。
　　 5.副豬嗜血桿菌毒力表型進(jìn)化規(guī)律分析
　　 利用已知的20株巴氏桿菌科基因組序列,通過(guò)16S rDNA和35個(gè)保守基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)以及基因組同源基因作圖分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)巴斯德菌科菌種存在兩個(gè)進(jìn)化分支,副豬嗜血桿菌與胸膜肺炎放線桿菌遺傳進(jìn)化上最接近,而與嗜血桿菌屬其他成員親

9、緣關(guān)系較遠(yuǎn),證實(shí)副豬嗜血桿菌分類(lèi)上獨(dú)立于嗜血桿菌屬之外形成一個(gè)相對(duì)獨(dú)特的進(jìn)化分支。
　　 通過(guò)比較該科成員中致病菌株與非致病菌株基因組,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌科成員存在的基因組減少進(jìn)化規(guī)律,比較29755與SH0165基因組發(fā)現(xiàn),兩株副豬嗜血桿菌的差異主要在噬菌體基因組成和數(shù)量上。結(jié)合SH0165基因組特點(diǎn),推測(cè)噬菌體介導(dǎo)的外源毒力相關(guān)基因的水平轉(zhuǎn)移和宿主菌功能基因的丟失(形成較多假基因)導(dǎo)致SH0165菌株經(jīng)歷一個(gè)基因組快速變化階段,而