自噬和TGF--β表達與副豬嗜血桿菌的致病性研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis）屬于巴氏桿菌科嗜血桿菌屬，是一種非溶血性的、依賴于NAD、具有多種形態(tài)的革蘭氏陰性菌。該菌是豬Glasser's病的病原，以多發(fā)性漿膜炎/關(guān)節(jié)炎、腦膜炎以及敗血癥為主要特征。副豬嗜血桿菌的感染可引發(fā)豬群的高發(fā)病率和死亡率，并且經(jīng)常與其它病原體混合感染或繼發(fā)感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。但是關(guān)于副豬嗜血桿菌致病機制的研究目前主要集中于其免疫逃避機制以及其毒力因子方面，很少有關(guān)于

2、副豬嗜血桿菌與宿主細胞之間相互作用的研究。
　　細胞自噬是真核細胞所特有的一種胞內(nèi)機制，是細胞對不利于自身生存的外部刺激發(fā)生的一種非特異性應(yīng)答，通過蛋白酶消化細胞內(nèi)聚集的短壽命蛋白或通過形成自噬體將受損細胞器或長壽命蛋白運送到溶酶體內(nèi)消化，從而維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，對細胞健康的維持發(fā)揮重要作用。自噬在哺乳動物細胞針對胞內(nèi)病原體感染的天然免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用，目前已發(fā)現(xiàn)多種病毒、細菌、真菌及寄生蟲可誘導(dǎo)哺乳動物細胞發(fā)生自噬。

3、>　　TGF-β1是一種多功能的多肽生長因子，是多種免疫細胞的自分泌或旁分泌調(diào)節(jié)因子，廣泛參與調(diào)節(jié)生物活性，包括細胞分化、血管生成、細胞程序性死亡，纖維化和細胞免疫等。TGF-β1還有一個重要的作用就是調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)蛋白，如纖連蛋白(Fn)、膠原蛋白、層粘連蛋白，以及幾種整合素蛋白（integrin）的表達，可以借此影響病原體對宿主細胞的吸附和侵入能力。
　　在本研究中，首先我們證實了副豬嗜血桿菌在感染PK-15細胞的過程中可以誘

4、導(dǎo)自噬，在此基礎(chǔ)上，我們進一步研究了副豬嗜血桿菌誘導(dǎo)自噬與其毒力及對細胞的侵襲力之間的關(guān)系，闡明了自噬在副豬嗜血桿菌感染過程中發(fā)揮的作用，并初步探究了副豬嗜血桿菌誘導(dǎo)自噬的信號通路;另一方面，我們研究了TGF-β1對副豬嗜血桿菌吸附和侵入能力的影響，并借助RNA干擾實驗闡明了TGF-β1與副豬嗜血桿菌之間的相互作用是通過纖連蛋白(Fn)以及整合素蛋白（integrin）α5這個中間介質(zhì)來完成。另外，我們也初步探究了TGF-β1與自噬之間

5、的關(guān)系。具體研究如下:
　　1副豬嗜血桿菌感染誘導(dǎo)PK-15細胞發(fā)生自噬
　　副豬嗜血桿菌（H.parasuis）作為一種豬體上呼吸道常在菌，在應(yīng)激條件下，會引起豬的Glasser豬的病。但是目前對其致病機制的研究主要集中在免疫逃避和對其毒力因子的研究上，不能反映副豬嗜血桿菌在感染過程中與宿主細胞之間的相互作用。自噬是病原體與宿主相互作用的一個重要紐帶，但是目前還沒有關(guān)于自噬在副豬嗜血桿菌感染中的報道。本研究闡明了副豬嗜血桿

6、菌感染PK-15細胞過程中誘導(dǎo)自噬的情況，借助于串聯(lián)表達GFP/RFP/LC3蛋白的雙標簽腺病毒，通過Western-blot、激光共聚焦顯微鏡以及透射電鏡這三個方面證實副豬嗜血桿菌能在PK-15細胞中誘導(dǎo)明顯的自噬，而且自噬水平的高低與副豬嗜血桿菌的復(fù)制和增殖有關(guān);另外，我們進一步研究了自噬與副豬嗜血桿菌毒力之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)副豬嗜血桿菌毒力與誘導(dǎo)自噬的能力以及侵入能力呈正相關(guān);最后，通過RNA干擾實驗驗證幾個經(jīng)典自噬相關(guān)蛋白Becli

7、n-1/ATG5和ATG7的作用，初步確定副豬嗜血桿菌誘導(dǎo)的自噬是通過Beclin1-Atg5-Atg7這條經(jīng)典通路。
　　2 TGF-β通路對副豬嗜血桿菌感染PK-15細胞的影響
　　TGF-β1可以通過調(diào)控纖連蛋白(Fn）、整合素蛋白（integrin）或者其他細胞外基質(zhì)蛋白（ECM蛋白）的表達從而在細菌入胞過程中發(fā)揮著重要作用。我們推測TGF-β1的水平也會對副豬嗜血桿菌入侵PK-15細胞有著一定的影響。研究發(fā)現(xiàn)以下幾

8、個方面，感染副豬嗜血桿菌的PK-15細胞上清TGF-β1表達水平升高。對PK-15細胞進行TGF-β1預(yù)處理能顯著降低副豬嗜血桿菌的入侵量。TGF-β1預(yù)處理或者副豬嗜血桿菌感染都能使PK-15細胞纖連蛋白(Fn)和整合素蛋白α5（integrin）表達量明顯升高。通過用特異性的RNA干擾片段干擾PK-15細胞中Fn和α5的表達會引起副豬嗜血桿菌侵入能力增強，特別是干擾α5會同時引起副豬嗜血桿菌吸附能力增強，F(xiàn)n的干擾沒有此效果。我們的