副豬嗜血桿菌dsbA基因缺失株的構(gòu)建及功能研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌（Haemo philuspara suis，HPS）是豬體內(nèi)一種條件致病菌，定植在豬上呼吸道，可以引起以漿液性纖維素性滲出為主要病理變化的關(guān)節(jié)炎、腦膜炎等，但是關(guān)于副豬嗜血桿菌主要的毒力因子及其致病機制尚不十分清楚。dsbA基因編碼一種二硫鍵折疊酶，在許多分泌蛋白及外膜蛋白的正確折疊及準確定位過程中發(fā)揮重要作用。為了研究dsbA基因在副豬嗜血桿菌致病過程中發(fā)揮的主要功能，本實驗構(gòu)建了dsbA基因缺失突變株來研究其在粘附、抵

2、抗吞噬細胞殺傷過程中發(fā)揮的主要作用。
　　1構(gòu)建pK18-D1K、pK18-D2E重組質(zhì)粒
　　根據(jù)SH0165全基因組序列設(shè)計引物擴增CF7066中dsbA1、dsbA2基因上下游同源臂及kanerm抗性盒，并在上下游同源臂的兩端加上USS序列。通過重疊PCR將dsbA1、dsbA2基因的上下游同源臂及相對應(yīng)的抗性盒進行連接，對重組片段和pK18mobsacB質(zhì)粒載體進行相同的雙酶切，并用T4Ligase進行連接轉(zhuǎn)化后轉(zhuǎn)入

3、大腸桿菌DH5α。長出的轉(zhuǎn)化子進行鑒定，得到了pK18-D1K、pK18-D2E重組質(zhì)粒且沒有任何堿基突變。
　　2dsbA1、dsbA2單基因缺失株及雙基因缺失株的構(gòu)建
　　用重組質(zhì)粒pK18-D1K、pK18-D2E依次與HPS進行自然轉(zhuǎn)化，得到了含有kan抗性的dsbA1基因缺失株、含有erm抗性的dsbA2基因缺失株。在此基礎(chǔ)上，用pK18-D2E自然轉(zhuǎn)化含有kan抗性的dsbA1基因缺失株，篩選并得到了含有kan和

4、erm抗性dsbA1、dsbA2雙基因缺失株。
　　3基因缺失株的鑒定
　　普通PCR擴增16SrRNA、抗性盒、目的基因初步驗證得到了基因缺失株;用同一引物分別對野生菌株及缺失株進行擴增，并通過Blast序列比對結(jié)果表明確實發(fā)生了抗性盒與目的基因dsbA的等位替換;用設(shè)計的目的基因及抗性盒內(nèi)部引物對野生菌株和基因缺失株的cDNA進行擴增，結(jié)果表明目的基因不能表達而抗性盒基因可以表達。用目的基因?qū)?yīng)的上下游基因的內(nèi)部引物對各

5、基因缺失株的cDNA進行擴增，證明得到的缺失株沒有產(chǎn)生極性效應(yīng)。
　　4dsbA基因功能研究
　　通過繪制野生菌株及各基因缺失株OD600-時間曲線，證明了dsbA1、dsbA2單基因及雙基因缺失株與野生菌株相比沒有差別，且相同OD600值對應(yīng)的活菌數(shù)也基本一致。
　　同時進行了細菌與細胞作用后，用乳酸脫氫酶(LDH)細胞毒性試劑盒對培養(yǎng)上清中的LDH活性進行檢測，來研究dsbA基因缺失后對細胞毒性的影響。通過對PK-

6、15細胞和RAW細胞毒性實驗發(fā)現(xiàn)，dsbA1基因在對RAW細胞毒性作用中發(fā)揮主要作用，且該細胞毒性作用在體細胞PK-15中沒有體現(xiàn)。
　　細菌的粘附實驗表明dsbA1、dsbA2基因缺失后均表現(xiàn)為對PK-15細胞的粘附能力增強，其中dsbA2基因在粘附功能中發(fā)揮的作用強于dsbA1基因。
　　進一步的吞噬實驗結(jié)果顯示dsbA1、dsbA2基因缺失以后均表現(xiàn)為抵抗RAW細胞吞噬能力減弱，dsbA2基因缺失以后還表現(xiàn)為吞噬細胞內(nèi)