fmo同源基因在綠僵菌生長(zhǎng)、發(fā)育及致病過(guò)程中的作用研究.pdf

1、黃素單加氧酶(monooxygenaseFAD-binding，F(xiàn)MO)普遍存在于哺乳動(dòng)物組織的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，能廣泛的氧化含硫和含氮的外源性物質(zhì)，代謝有毒或者致癌性物質(zhì)，有解毒功能。然而目前對(duì)FMO在絲狀真菌中的作用尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中發(fā)現(xiàn)，綠僵菌中有一fmo同源基因在綠僵菌侵染宿主后在宿主體內(nèi)能高表達(dá)，可能與侵染毒力相關(guān)。研究綠僵菌fmo（Mafmo）基因功能不僅有助于進(jìn)一步明確真菌的致病機(jī)制，同時(shí)也為篩選新的抗真菌藥物或高毒力菌

2、株提供理論依據(jù)。本研究運(yùn)用基因敲除技術(shù)構(gòu)建Mafmo敲除載體獲得穩(wěn)定的敲除菌株(ΔMafmo)，分析了Mafmo基因?qū)G僵菌侵染毒力、生長(zhǎng)發(fā)育及抗逆性的影響。
　　主要研究?jī)?nèi)容：
　　1.Mafmo序列的生物信息學(xué)分析
　　從實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的綠僵菌在宿主體內(nèi)特異表達(dá)基因的差減文庫(kù)中選擇編號(hào)為CJY1439的EST序列,在NCBI上進(jìn)行Blastx比對(duì)，分析該序列與其他基因的同源性；采用nucleotideblasts搜索出

3、CJY1439對(duì)應(yīng)的基因組序列；用GENSCAN1.0和GeneMark預(yù)測(cè)其氨基酸序列。
　　2.獲得Mafmo基因的敲除菌株
　　設(shè)計(jì)引物，從野生型綠僵菌Ma102基因組DNA中擴(kuò)增出Mafmo的左、右臂DNA片段，分別插入pK2-PB載體Bar基因的5端或3端，構(gòu)建Mafmo的敲除載體。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法產(chǎn)生Mafmo基因的敲除菌株。通過(guò)PCR分析和Southernblotting的方法鑒定Mafmo基因的敲除菌株。

4、
　　3.Mafmo基因的功能分析
　?、臡afmo基因?qū)Χ玖Φ挠绊?br>　　將Mafmo敲除菌株或野生型菌株新鮮孢子配制成的孢懸液，分別采用體內(nèi)注射或體表侵染兩種途徑研究Mafmo敲除菌株與野生型菌株對(duì)宿主毒力的作用。通過(guò)觀察經(jīng)過(guò)兩種途徑處理后宿主的死亡時(shí)間，分析半致死時(shí)間的變化，以明確Mafmo基因?qū)Χ玖Φ挠绊憽?br>　?、芃afmo基因在綠僵菌侵染中的作用
　?、費(fèi)afmo基因?qū)G僵菌在宿主血腔中生長(zhǎng)的影響<

5、br>　　活體觀察：將Mafmo敲除菌株或野生型菌株新鮮孢子配制成的孢懸液通過(guò)體內(nèi)注射宿主后，取宿主血液觀察蟲菌體數(shù)量。
　　離體觀察：取新鮮的宿主血液，去除或不去除血細(xì)胞，分別接種Mafmo敲除菌株或野生型菌株新鮮孢子配置成的孢懸液，觀察孢子萌發(fā)、生長(zhǎng)情況。
　　②Mafmo基因在綠僵菌侵染初期的作用
　　孢子萌發(fā)及附著胞形態(tài)的觀察：將Mafmo敲除菌株或野生型菌株新鮮孢子配制成的孢懸液分別接種于宿主后翅，觀察孢子萌

6、發(fā)及侵染結(jié)構(gòu)附著胞的形成時(shí)間，分析兩者之間是否存在差異。
　?、荕afmo基因?qū)G僵菌抗逆生長(zhǎng)的影響
　　在高滲透壓（0.4MKCl，1M山梨醇，1M甘露醇）、高氧化劑（30％H2O2）、細(xì)胞壁干擾劑（50μg/mL熒光增白劑，500μg/mL剛果紅，0.01%十二烷基磺酸鈉）或缺氧條件下培養(yǎng)Mafmo敲除菌株或野生型菌株新鮮孢子配制成的孢懸液，觀察其在形態(tài)、產(chǎn)孢量、生物量積累的差異。
　　主要研究結(jié)果：
　　1

7、.EST序列編號(hào)為CJY1439，長(zhǎng)度710bp。Blastx比對(duì)發(fā)現(xiàn)CJY1439對(duì)應(yīng)的基因組序列與monooxygenaseFAD-binding(FMO)有同源性，因此將此基因命名為Mafmo。該基因編碼193個(gè)氨基酸，分子量為21.8kDa，等電點(diǎn)pI為8.14，不含有信號(hào)肽。
　　2.通過(guò)PCR分析和Southernblotting鑒定，證實(shí)獲得了4個(gè)穩(wěn)定的Mafmo敲除菌株（△Mafmo1、△Mafmo3、△Mafmo

8、5、△Mafmo6）。
　　3.Mafmo基因的功能分析結(jié)果：
　?、派锒玖y(cè)定結(jié)果顯示：體內(nèi)注射孢懸液后，Mafmo敲除菌株較野生型菌株對(duì)宿主的半致死時(shí)間顯著提前（Mafmo敲除菌株對(duì)宿主的半致死時(shí)間為：△Mafmo3的為3.83±0.10d；△Mafmo5的為3.59±0.13d；△Mafmo6的為3.23±0.21d，野生型菌株對(duì)宿主的半致死時(shí)間為：4.99±0.17d）；體表侵染孢懸液后，Mafmo敲除菌株和野生型

9、菌株二者對(duì)宿主的的半致死時(shí)間沒有顯著差異。結(jié)果表明Mafmo基因影響綠僵菌的毒力。
　?、脾倩铙w血液培養(yǎng)結(jié)果顯示：野生型菌株或Mafmo敲除菌株新鮮孢子配制成的孢懸液通過(guò)體內(nèi)注射進(jìn)入宿主體內(nèi)后，取宿主血液觀察發(fā)現(xiàn)Mafmo敲除菌株較野生型菌株產(chǎn)生的蟲菌體不僅出現(xiàn)的早且多，數(shù)量差異顯著；離體血液培養(yǎng)結(jié)果顯示：全血培養(yǎng)36h時(shí)間后，野生型菌株較Mafmo敲除菌株在菌體數(shù)上要少，差異顯著；用不含血細(xì)胞的血液離體培養(yǎng)，野生型菌株與Mafm

10、o敲除菌株在菌體數(shù)上無(wú)顯著差異。②將Mafmo敲除菌株或野生型菌株新鮮孢子配制成的孢懸液分別接種于宿主后翅上，20h時(shí)野生型菌株的萌發(fā)率顯著高于Mafmo敲除菌株；二者的附著胞相對(duì)形成率卻沒有顯著差異。即Mafmo影響綠僵菌在宿主體表的萌發(fā)不影響其附著胞的形成。
　　以上①、②表明：Mafmo基因不僅在綠僵菌進(jìn)入宿主血腔后具有功能活性，還影響了綠僵菌侵染初期的生長(zhǎng)發(fā)育。
　?、窃诟邼B透壓、高氧化劑、干擾劑和缺氧條件下培養(yǎng)Ma