水稻矮縮病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Pns10的介體互作因子的篩選與功能驗證.pdf

1、水稻矮縮病毒（RDV）屬于持久增殖型病毒，主要由介體黑尾葉蟬傳播。在葉蟬內(nèi)，病毒利用自身編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白Pns10形成包裹病毒粒體的小管通道，采取“小管運輸病毒”的策略進(jìn)行安全擴散，以抵御葉蟬的各種免疫攻擊。這種安全運輸病毒策略需要介體蛋白共同參與才能順利完成，先前研究表明Pns10通過酵母雙雜交篩選到介體互作蛋白肌動蛋白（actin）、肌球蛋白（myosin）等，黑尾葉蟬胞質(zhì)型actin與Pns10的特異性互作決定黑尾葉蟬?；詡鞑

2、DV，這些為Pns10互作介體蛋白的篩選提供了基礎(chǔ)。
　　鑒于此，本研究繼續(xù)利用核蛋白互作的Clontech酵母雙雜交系統(tǒng)篩選數(shù)量相等的成蟲和若蟲的黑尾葉蟬cDNA庫，獲取陽性克隆。在NCBI Blastx進(jìn)行序列比對分析后，預(yù)測篩選的基因功能多為與昆蟲生長發(fā)育、細(xì)胞成分等相關(guān)，挑選6個可能互作的蛋白：原肌球調(diào)節(jié)蛋白（Tmod），線粒體孔蛋白（mitochondrial porin,Mito P），運脂蛋白前體（LP），高密度脂蛋

3、白結(jié)合蛋白（Vigilin），凋亡誘導(dǎo)因子（AIF），卵黃原蛋白（Vg），將這6種蛋白的酵母質(zhì)粒與pGBKT7-Pns10再次回轉(zhuǎn)酵母感受態(tài)細(xì)胞AH109，確定Pns10與候選蛋白互作。雙分子免疫熒光互補技術(shù)（BiFC），證明Tmod、Vg和LP與Pns10互作，而Mito P、AIF和vigilin與Pns10不互作。在本氏煙共定位表達(dá)系統(tǒng)中， Tmod和Vg，vigilin，LP均能與RDV Pns10共定位，而Mito P、AIF

4、不與Pns10共定位。
　　為進(jìn)一步明確6個候選蛋白在 RDV擴散中發(fā)揮的作用，利用RT-qPCR實驗檢測6個候選蛋白基因在帶毒培養(yǎng)細(xì)胞和黑尾葉蟬中的相對表達(dá)量。結(jié)果表明除 Mito P與對照組無明顯差別外，其余5個基因的相對表達(dá)量均高于對照組。
　　由于Tmod作為actin慢生長端的唯一蓋帽蛋白，是actin的相關(guān)蛋白，而包裹病毒Pns10小管運動是沿著actin纖維絲進(jìn)行病毒的運輸。利用GST-Pull down實驗證

5、明Tmod能與RDV Pns10在體外發(fā)生特異性互作；Tmod熒光抗體免疫標(biāo)記帶毒培養(yǎng)細(xì)胞和黑尾葉蟬消化道，Tmod定位在微絨毛上，與Pns10共定位，Pns10小管能夠穿出actin形成的微絨毛。RT-qPCR分析Tmod、Pns10、RDV P8在帶毒葉蟬中的表達(dá)趨勢相似。利用dsTmod抑制Tmod在介體中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Tmod、Pns10和P8表達(dá)量明顯下降。并且干擾Tmod表達(dá)的第14天，蟲體的帶毒率也下降了一半。因此， Tmo

6、d對Pns10行使功能有正調(diào)控作用，Pns10小管依賴于actin的小管動力（ABTM）充分利用Tmod在介體中的調(diào)控作用，以至于actin能夠無限延伸，反向便捷了Pns10小管插入鄰近細(xì)胞，甚至為突破介體組織膜屏障提供動力，最終實現(xiàn)病毒擴散。
　　Vg為卵黃蛋白前體，是卵發(fā)育的營養(yǎng)物質(zhì)，在脂肪體上合成釋放到血淋巴中，最終被卵巢吸收。利用GST-Pull down實驗進(jìn)一步確定Pns10與Vg互作。免疫熒光抗體標(biāo)記培養(yǎng)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)V