南方水稻黑條矮縮病毒與水稻齒葉矮縮病毒協(xié)生作用研究.pdf

1、南方水稻黑條矮縮病毒（Southern rice black-streaked dwarfvirus,SRBSDV）和水稻鋸齒葉矮縮病毒(Rice ragged stunt virus,RRSV）同屬于呼腸孤病毒科，前者屬于斐濟病毒屬，由白背飛虱以持久性增殖型方式傳播，后者屬于水稻病毒屬，由褐飛虱以持久性增殖型方式傳播。SRBSDV是2001年于廣東省陽西縣首次發(fā)現(xiàn)、2008年鑒定的水稻病毒新種，近年來迅速擴散至越南北部及我國南部廣大稻

2、區(qū)，成為生產上最主要的病害之一。RRSV在中國自1978年首次發(fā)現(xiàn)以來，一直零星發(fā)生，僅個別年份和田塊發(fā)生較重。然而近年來伴隨SRBSDV的大面積爆發(fā)，RRSV在中國南部呈加重為害的趨勢，田間出現(xiàn)大量的SRBSDV和RRSV復合侵染病株。復合侵染的病毒可能發(fā)生協(xié)生作用，通過增加寄主體內病毒含量，加重病株癥狀表現(xiàn)，提高介體傳毒效率，對農業(yè)生產造成更為嚴重危害。為了揭示SRBSDV和RRSV復合侵染時兩種病毒的互作，本文展開了一系列研究，主

3、要結果如下：
　　1.復合侵染的水稻植株內SRBSDV和RRSV發(fā)生了協(xié)生作用，病害癥狀加劇，病毒含量提高。癥狀觀察表明，復合侵染導致水稻植株顯癥時間提前，接毒后第15 d，50％復合侵染植株上部新生葉片就出現(xiàn)葉尖扭曲癥狀，而SRBSDV和RRSV單獨侵染的植株在20d時才觀察到該癥狀。在接種后9d、15d和20d時，復合侵染植株的高度分別僅為健康植株的87.8%、50.8%和32.8%，是SRBSDV單獨侵染時的90.6%、83

4、.3%和75.5%，是RRSV單獨侵染時的92.4%、67.7%和58.4%，復合侵染造成的植株矮縮顯著重于單獨侵染。RT-qPCR對病株中兩病毒所有基因表達水平的檢測結果表明，與單獨侵染相比，早（9d）、中（15d）和后（20d）期3個病程點復合侵染植株體內SRBSDV P5-1、P7-1、P9-1和P10以及RRSV P3、P6、P8和P10表達水量均顯著增加。在這些上調表達的病毒基因中，除殼蛋白基因外，均為病毒復制工廠（病毒基質）

5、組份相關基因，暗示復合侵染時兩種病毒的復制能力受到了相互促進。
　　2.白背飛虱和褐飛虱從復合侵染植株上獲毒效率顯著提高。與單獨侵染植株相比，在病程第9d、15d和20d的植株上飼毒24 h，白背飛虱和褐飛虱從復合侵染植株上的獲毒效率分別提高了7.4%、27.8%、21.2%和11.5%、19.3%、15.3%。表明SRBSDV和RRSV的協(xié)生同時增加了兩種病毒介體的獲毒效率，因此，SRBSDV的暴發(fā)不但直接對水稻生產構成威脅，而

6、且通過與RRSV協(xié)生，提高兩病毒介體獲毒能力，加劇兩病毒的流行。
　　3.兩病毒復合侵染導致水稻更嚴重的細胞病理學變化。透射電鏡觀察表明，無論是病程早（9d）、中（15d）和晚（20d）期，SRBSDV和RRSV復合侵染均比單獨侵染引致更嚴重的細胞病理學變化，主要表現(xiàn)在病株上部第一平展葉韌皮部細胞內的病毒粒體數(shù)量和病毒基質數(shù)量均顯著增多；葉肉細胞中葉綠體腫大更為嚴重，線粒體數(shù)量和嗜鋨顆粒數(shù)量均顯著增加，脂滴增大更為明顯，反映了兩病

7、毒協(xié)生需消耗更多能量，寄主脂類代謝嚴重受阻，細胞器受損更為嚴重。
　　4.兩病毒復合侵染對水稻RNA沉默途徑關鍵蛋白基因表達模式的影響明顯不同于單獨侵染。采用RT-qPCR分析了感病水稻植株8個DCL(OsDCLs),19個AGO(OsAGOs)以及5個RDR(OsRDRs)的表達水平，結果表明，兩病毒單獨及復合侵染均會導致OsAGO11及OsAGO18的表達上調，其中復合侵染時OsAGO11的上調幅度顯著大于SRBSDV單獨侵染

8、，在病程9d、15d和20d時，分別是SRBSDV單獨侵染時的1.26倍、1.55倍和1.83倍；但與RRSV單獨侵染時表達量差異不顯著。OsAGO18的表達，在復合侵染與兩病毒單獨侵染之間不存在顯著差異。兩病毒單獨侵染對8個OsDCLs的表達均不造成顯著影響，但復合侵染時有時3個OsDCLs（OsDCL2a、OsDCL3b和 OsDCL4）的表達被顯著上調。兩種病毒單獨及復合侵染均使OsRDR1及OsRDR4表達上調，而復合侵染時兩者

9、的上調幅度顯著升高，在病程9d、15d和20d時，復合侵染植株中OsRDR1的表達分別是SRBSDV單獨侵染時的7.81、9.00和9.98倍，是RRSV單獨侵染時的8.35、9.69和10.14倍；OsRDR4的表達分別是SRBSDV單獨侵染時的4.56、9.11和10.76倍，是RRSV單獨侵染時的4.82、5.56和5.83倍。表明SRBSDV和RRSV協(xié)生深刻影響了水稻RNA沉默路徑。
　　5.兩病毒RNA沉默抑制子的功能

10、具有加性效應。利用農桿菌共浸潤的方法，以轉GFP基因本生煙16c為材料，分析了SRBSDV的沉默抑制子SP6和RRSV的沉默抑制子RP6單獨及復合作用對GFP沉默抑制的活性。注射后1d，SP6和RP6單獨處理分別僅19.83%和30.42%的浸潤區(qū)域觀察到微弱的綠色熒光，而兩者復合處理則有高達89.02%的浸潤區(qū)域觀察到明顯的綠色熒光；同時，復合處理浸潤區(qū)域GFP mRNA表達水平顯著高于SP6和RP6單獨處理浸潤區(qū)域，分別是后兩者的3

11、.36倍和3.18倍。注射后2d，各處理的綠色熒光信號均達到最強，復合浸潤區(qū)域GFP mRNA表達量分別是SP6和RP6單獨浸潤區(qū)域的1.12倍和1.14倍，但差異不顯著。注射后3d，SP6和RP6單獨浸潤的區(qū)域綠色熒光信號開始減弱，而兩者復合浸潤區(qū)域仍保持明顯的綠色熒光；同時，復合浸潤區(qū)域GFP mRNA表達量分別是SP6和RP6單獨浸潤區(qū)域的2.04倍和1.39倍，差異顯著。結果表明，RP6比SP6抑制效果更強，而兩病毒沉默抑制子的