水稻缺刻蛋白在水稻齒葉矮縮病毒侵染模式下的表達.pdf

1、水稻齒葉矮縮病是由褐飛虱（Nilaparvata Lugens）傳播的病毒病，其病原是水稻鋸齒葉矮縮病毒（Rice ragged stunt virus,RRSV），最明顯的癥狀表現(xiàn)為葉片卷縮、葉緣鋸齒。有研究發(fā)現(xiàn)缺刻蛋白（serrate protein,SE protein）基因在調節(jié)植物葉片的發(fā)育中起著重要的作用，并且本實驗室通過RT-PCR檢測RRSV侵染后水稻體內(nèi)缺刻蛋白基因的表達量，發(fā)現(xiàn)RRSV侵染后水稻中缺刻蛋白SE-1基因

2、的表達量是明顯上調，而SE-2、SE-3基因的表達量與健康水稻相比差異不明顯。
　　為了研究水稻中SE啟動子的功能，本實驗構建了SE啟動子的植物表達載體。分別命名為Pro-SE-1、Pro-SE-2、Pro-SE-3。通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化法和FloralDip法分別將其轉入日本晴水稻和擬南芥中，PCR檢測結果表明所有T0代轉基因水稻中共有75株抗性植株，其中Pro-SE-1T0代抗性植株27株，Pro-SE-2T0代抗性植株4

3、3株，Pro-SE-3T0代抗性植株5株。通過抗性篩選獲得了擬南芥T1代抗性植株。
　　利用GUS組織化學染色法對抗性植株進行組織定位分析，結果顯示GUS基因在轉基因水稻的葉片中都有表達，Pro-SE-1轉基因水稻中GUS基因的表達在葉片中表達較弱，根和莖中沒有檢測到GUS基因的表達，而轉Pro-SE-2、Pro-SE-3基因的水稻中根、葉中有表達而且在根毛區(qū)表達強烈，葉緣處表達較明顯。通過GUS基因的表達量分析結果顯示，與對照相

4、比GUS基因在轉基因水稻中都有不同程度的表達。而Pro-SE-1啟動子驅動的GUS基因的表達量與轉Pro-SE-2啟動子基因水稻中SE-1缺刻蛋白基因的表達量幾乎呈正相關性。在擬南芥中，GUS在轉基因擬南芥植株中不同部位均有表達，在花藥、幼葉中表達強烈，莖中沒有檢測到GUS基因的表達。
　　分析轉基因水稻表型發(fā)現(xiàn)轉Pro-SE-2基因的水稻植株表型表現(xiàn)出卷葉、缺刻的癥狀，轉Pro-SE-3基因的水稻葉片皺縮，Pro-SE-1轉基因

5、水稻未發(fā)現(xiàn)表型特異。通過實時熒光定量PCR技術分別對Pro-SE-1、Pro-SE-2、Pro-SE-3轉基因水稻中三個缺刻蛋白SE-1、SE-2、SE-3基因的表達量進行了分析，結果表明：轉Pro-SE-1基因水稻中三個缺刻蛋白SE-1、SE-2、SE-3基因的表達量總體呈下調趨勢，而轉Pro-SE-2基因的水稻中SE-1基因表達量上調且有顯著性差異，SE-2、SE-3基因的表達量無明顯差異，轉Pro-SE-3基因的水稻中SE-1的基

6、因表達量下調，SE-2、SE-3的基因表達量上調但不顯著。
　　為了進一步研究轉基因水稻中啟動子與缺刻蛋白基因間的表達量關系，本實驗制備了三個缺刻蛋白的多克隆抗體，并經(jīng)過ELISA檢測和western blot檢測，發(fā)現(xiàn)三個缺刻蛋白的抗體效價都很好，可以用作水稻缺刻蛋白表達量的檢測。
　　綜上所述，Pro-SE-2啟動子基因可能促進了水稻中內(nèi)源基因SE-1的高表達，Pro-SE-3啟動子可能驅動了其自身缺刻蛋白基因的高表達。