水稻條紋病毒病程相關(guān)蛋白SP寄主互作因子的分離鑒定及水稻齒輪葉矮縮病毒單克隆抗體的制備和應(yīng)用.pdf

1、水稻條紋病毒（Rice stripe virus，RSV）近年來嚴(yán)重影響了我國水稻的產(chǎn)量。該病毒是纖細(xì)病毒屬(Tenuivirus)的典型成員，病毒粒子為絲狀體，介體昆蟲為灰飛虱(Laodelphax Striatellus Fallen)，以持久循回增殖型的方式進(jìn)行傳播。為了分析水稻條紋病毒的致病機(jī)理，本文對(duì)與水稻條紋病毒病程相關(guān)蛋白SP互作的寄主因子進(jìn)行分離、鑒定。
　　 用酵母雙雜交的方法分離寄主互作因子，即誘餌質(zhì)粒pGB

2、KT7-SP和水稻cDNA文庫的質(zhì)粒pGADT7-Rec-cDNA共轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2H Gold，通過三缺和四缺營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上的生長情況，初步選定寄主互作因子基因片段。寄主因子基因片段經(jīng)測序分析，并進(jìn)一步進(jìn)行回轉(zhuǎn)驗(yàn)證，鑒定了與SP互作的R3H domain蛋白為候選水稻寄主因子。從健康水稻葉片中克隆了這個(gè)基因的全長序列后，構(gòu)建酵母雙雜交載體pGBKT7-SP與pGADT7-R3H，將兩個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2H Gold后，發(fā)現(xiàn)R3

3、H domain蛋白能在酵母營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上生長，說明SP蛋白和R3H domain蛋白之間互作。同時(shí)構(gòu)建了雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(Bimolecularfluorescence complementation，BiFC)的重組質(zhì)粒YFPN-SP和YFPC-R3H，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌C58C1后，浸潤本氏煙葉片后，共聚焦顯微鏡下有明顯的黃色熒光，證實(shí)SP和R3H domain蛋白可以在煙草細(xì)胞中互作。R3H dmain蛋白的分離、鑒定為弄清RSV的

4、致病機(jī)理打下基礎(chǔ)。
　　 水稻齒葉矮縮病毒(Rice ragged stunt virus，RRSV)是呼腸弧病毒科(Reoviridae)水稻病毒屬(Oryzavirus)的成員，引起水稻齒葉矮縮病，目前嚴(yán)重影響我國的水稻生產(chǎn)。該病毒的傳播介體是褐飛虱(Nilaparvata lugens)，其以持久方式進(jìn)行傳播。
　　 從感染RRSV的水稻葉片中提取水稻總RNA，用RT-PCR方法克隆了RRSV的衣殼蛋白基因(CP)

5、后構(gòu)建到原核表達(dá)載體pMAL-C2X上，構(gòu)建成重組表達(dá)載體pMAL-C2X-CP，pMAL-C2X-CP轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)，經(jīng)0.5mM IPTG37℃誘導(dǎo)3小時(shí)表達(dá)重組蛋白。表達(dá)的重組融合蛋白經(jīng)AmyloseResin親和層析柱純化后，獲得RRSV的80KD左右的重組融合外殼蛋白。用得到的重組蛋白免疫老鼠，取免疫老鼠的脾臟細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞融合，經(jīng)過細(xì)胞篩選、克隆后得到1株能夠穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株4H5，