水稻條紋病毒功能蛋白與水稻葉綠體蛋白的互作.pdf

1、近些年，由水稻條紋病毒(Rice stripe virus，RSV)引起的水稻條紋葉枯病在許多地區(qū)爆發(fā)，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的損失和危害。本文在水稻條紋病毒功能蛋白篩選水稻cDNA文庫的基礎(chǔ)上，用酵母雙雜交和免疫共沉淀技術(shù)從分子水平上進(jìn)一步研究RSV功能蛋白NSvc4與水稻葉綠體蛋白NB2之間，RSV功能蛋白SP與水稻葉綠體蛋白SB16之間的相互作用；以及用熒光定量PCR技術(shù)在mRNA水平檢測水稻葉片葉綠體NB2基因在病毒侵染前后的表達(dá)

2、量變化；同時在RSV外殼蛋白CP能夠自身互作的基礎(chǔ)上，用酵母雙雜交技術(shù)進(jìn)一步確定其自身互作的氨基酸部位。 首先為了進(jìn)一步驗證RSV NSvc4蛋白與水稻葉綠體蛋白NB2之間，RSV蛋白SP與水稻葉綠體蛋白SB16之間的相互作用，提取水稻幼嫩葉片總RNA后，通過RT-PCR擴(kuò)增獲得水稻葉綠體基因NB2和SB16全長序列，分別將其連接到酵母雙雜交載體pGADT7，構(gòu)建成重組子pGAD-NB2、pGAD-SB16。將誘餌質(zhì)粒pGBK-

3、NSvc4、pGBK-SP、pGBK-CP分別與重組子pGAD-NB2及pGAD-SB16共轉(zhuǎn)化酵母菌AH109，并涂布不同營養(yǎng)缺陷型選擇性培養(yǎng)基平板，檢測RSV NSvc4、SP及CP與葉綠體蛋白NB2、SB16的互作情況。結(jié)果表明，水稻葉綠體蛋白NB2能與RSV NSvc4發(fā)生互作，而與CP、SP不能互作；水稻葉綠體蛋白SB16均不與NSvc4、CP及SP互作。 其次，用免疫共沉淀技術(shù)在胞內(nèi)自然生理條件下進(jìn)一步驗證酵母雙雜交

4、實驗結(jié)果的可靠性。以構(gòu)建好的酵母表達(dá)載體pGAD-NB2、pGAD-SB16為模板，分別擴(kuò)增獲得融合有HA標(biāo)簽的水稻葉綠體 NB2、SB16基因，并插入植物表達(dá)載體pEGAD載體，構(gòu)建成重組植物表達(dá)載體pEGAD-NB2、pEGAD-SB16，然后將重組植物表達(dá)載體和帶有c-Myc標(biāo)簽的重組植物表達(dá)載體pEGAD-NSvc4、pEGAD-SP分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105后，農(nóng)桿菌處理后以不同的組合注射煙草。提取煙草中瞬時表達(dá)的蛋白，以HA

5、抗體或c-Myc抗體進(jìn)行免疫共沉淀實驗，最后免疫混合物通過c-Myc抗體或HA抗體進(jìn)行Western blot檢測，確定蛋白的互作情況。免疫沉淀檢測結(jié)果與酵母雙雜交實驗結(jié)果一致：水稻葉綠體蛋白NB2與RSV NSvc4蛋白存在互作，而與SP，CP之間不存在互作；水稻葉綠體蛋白SB16與RSV SP，CP及NSvc4蛋白均不存在互作。 再者，用Real Time PCR技術(shù)在mRNA水平上檢測水稻NB2基因在RSV侵染前后表達(dá)量的

6、差異，從而分析RSV侵染及病毒蛋白與寄主蛋白互作對其mRNA表達(dá)情況的影響。結(jié)果表明，與健康水稻葉片中的表達(dá)量相比，NB2基因mRNA在RSV侵染后的水稻葉片中表現(xiàn)為上調(diào)。 最后，本文還在RSV外殼蛋白CP能夠自身互作的基礎(chǔ)上，將CP基因分為N'端1～486 bp、M'端244～726 bp及C'端487～969 bp，用酵母雙雜交技術(shù)進(jìn)一步確定其自身互作的活性部位。實驗表明，N'端81個氨基酸是水稻條紋病毒CP蛋白自身互作的活

7、性中心。 綜上所述，通過酵母雙雜交和免疫共沉淀技術(shù)確定RSV功能蛋白NSvc4和水稻葉綠體蛋白NB2存在互作。經(jīng)序列分析，NB2基因編碼葉綠體有關(guān)蛋白，它與RSV NSvc4蛋白的互作讓人很容易地聯(lián)系RSV侵染引起的典型癥狀；然而這又與NSvc4功能有些不相符。因為先前的研究表明NSvc4似乎只在病毒侵染的早期表達(dá)，所以或者先前的研究并不準(zhǔn)確，即NSvc4的表達(dá)可能會持續(xù)相當(dāng)長的時間或至少能在病毒活躍侵染的位點穩(wěn)定大量的表達(dá)；或

8、者NSvc4可能與病毒的致病并不相關(guān)；最近有實驗表明NSvc4可能是RSV的運動蛋白，因此NB2蛋白可能在病毒的運動中發(fā)揮作用，但目前我們還不清楚其具體的運動機(jī)制。利用Real time PCR檢測到NB2基因的mRNA水平在健康水稻葉片比RSV侵染后的水稻葉片中較高，NB2為葉綠體亞基結(jié)合蛋白CPN-60 beta。因為葉綠體基因組與核基因組有著密切的交流，這種交流使得核基因組能夠準(zhǔn)確的了解細(xì)胞器的工作狀態(tài)和所處的環(huán)境。所以CPN-6

9、0 beta mRNA的上調(diào)可能與宿主自身的反饋調(diào)節(jié)有關(guān)，即很大一部分CPN-60 beta由于與NSvc4互作而不能發(fā)揮作用，這導(dǎo)致葉綠體功能的失調(diào)。為了彌補(bǔ)這種缺陷，宿主表達(dá)出更多的CPN-60 beta mRNA，從而生成更多的CPN-60 beta蛋白。另外，用酵母雙雜交技術(shù)確定RSV CP蛋白N'端81個氨基酸是水稻條紋病毒CP蛋白自身互作的活性中心，并且進(jìn)一步驗證這種互作，找到互作關(guān)鍵氨基酸位點及研究這種互作的意義，都將會進(jìn)