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文檔簡(jiǎn)介
1、南方水稻黑條矮縮病毒(SRBSDV)由介體白背飛虱傳播,不經(jīng)卵傳播。SRBSDV編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白P5-1、P6和P9-1是病毒復(fù)制和裝配的場(chǎng)所—病毒原質(zhì)(viroplasm)的組分。這三種非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒的復(fù)制過(guò)程中扮演著至關(guān)重要的作用。已知P6能分別與P5-1和P9-1互作,而P5-1和P9-1不能互作,那么這三種非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒原質(zhì)的形成過(guò)程中是否由某一個(gè)蛋白起著決定性的作用,需要我們深入的研究。
本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)免疫熒光標(biāo)
2、記技術(shù)在介體白背飛虱培養(yǎng)細(xì)胞中觀察SRBSDV侵染后P5-1、P6和P9-1表達(dá)的先后順序,結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)SRBSDV侵染18 h時(shí),P9-1沒(méi)有表達(dá),P6的表達(dá)量稍多于P5-1,且以顆粒狀形態(tài)分布在細(xì)胞質(zhì)周?chē)?6 h時(shí),P5-1和P6都大量表達(dá),而此時(shí)P9-1也開(kāi)始少量表達(dá);隨著侵染時(shí)間的延長(zhǎng),P5-1,P6和P9-1的表達(dá)量都顯著升高;72 h時(shí),三種非結(jié)構(gòu)蛋白均勻分布在細(xì)胞質(zhì)中。所以這三種蛋白表達(dá)的先后順序?yàn)镻6, P5-1和P9-
3、1。
其次,利用RNAi(RNA interference)干擾和免疫熒光標(biāo)記技術(shù)研究發(fā)現(xiàn),分別干擾P5-1、P6和P9-1在白背飛虱培養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá),均導(dǎo)致SRBSDV的侵染率顯著降低。同時(shí),抑制P5-1表達(dá)后, P5-1和P9-1的表達(dá)量明顯降低,但是P6的表達(dá)量和對(duì)照組相當(dāng);抑制P6表達(dá)后,P5-1、P6和P9-1的表達(dá)量都顯著降低;抑制P9-1表達(dá)后,除了自身蛋白的表達(dá)量降低外,另外兩個(gè)蛋白的表達(dá)水平不受影響。dsRN
4、As降低了目標(biāo)蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平,并且干擾P6的表達(dá)對(duì)病毒復(fù)制的影響最大。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)論。
最后,構(gòu)建目的基因N端融合e-GFP或mCherry的重組桿狀病毒表達(dá)載體,當(dāng) SRBSDV P5-1-eGFP、P6-mCherry和P9-1-mCherry在Sf9細(xì)胞中單獨(dú)表達(dá)時(shí),P5-1-eGFP彌散分布在細(xì)胞質(zhì)周?chē)?,P6-mCherry和P9-1
5、-mCherry都以顆粒狀分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。當(dāng)三種蛋白兩兩組合共同侵染時(shí), P6-mCherry與P5-1-eGFP和P9-1-eGFP都會(huì)共定位,形成顆粒狀的病毒原質(zhì),而這和實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的桿狀病毒表達(dá)載體Bacmid-SRBSDV-P5-1、P6和P9-1侵染Sf9細(xì)胞的結(jié)果是一致的。這一結(jié)果也進(jìn)一步說(shuō)明P6在SRBSDV病毒原質(zhì)的形成過(guò)程中起到了其他蛋白無(wú)法代替的作用。
綜合以上結(jié)果,本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平,通過(guò)觀察三種非結(jié)構(gòu)蛋白在
6、介體細(xì)胞中的表達(dá)順序,明確當(dāng)SRBSDV侵染介體白背飛虱細(xì)胞后,P6最早表達(dá),可能起重要的調(diào)控作用。借助于dsRNA誘導(dǎo)的RNAi、RT-qPCR和Western blot等技術(shù)手段證實(shí)了P6是病毒復(fù)制增殖過(guò)程中最關(guān)鍵的因子,啟動(dòng)病毒原質(zhì)的形成,P6能夠招募P5-1和P9-1一起形成病毒原質(zhì),P5-1和P9-1在病毒原質(zhì)中參與病毒基因組的復(fù)制和病毒粒體的裝配。因此,通過(guò)對(duì)P6的深入研究,有助于我們利用靶標(biāo)基因找到防治水稻病毒病的方法,為
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