水稻條紋病毒功能蛋白與其自身編碼蛋白及水稻蛋白間的互作.pdf

1、水稻條紋病毒(Rice stripe virus，RSV)引起的水稻條紋葉枯病是水稻上的一種重要病毒病，該病在我國(guó)的分布極為廣泛，并已經(jīng)給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重的損失。RSV是一種多組分RNA病毒，其基因組由4種單鏈RNA(single-stranded RNA，ssRNA)組成，它們共編碼7個(gè)蛋白，包括RNA的RNA聚合酶(RdRp)、NS2、NSvc2、CP、NS3、SP、NSvc4。 本文以RSV NSvc4為誘餌蛋白，在“武育

2、粳3號(hào)自然突變體”文庫(kù)上篩選到的NB15(brown planthopper-induced resistance protein1 contains CBS domain)、在“武育粳3號(hào)”文庫(kù)篩選到的NW1(CI2E contains InterPro domain(s)；Potato inhibitorⅠ family)蛋白作為對(duì)象，對(duì)它們與CP、SP、NSvc4之間的相互作用進(jìn)行驗(yàn)證。提取水稻RNA，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增獲得了水

3、稻NB15和NW1完整基因，分別將其與酵母雙雜交捕獲載體pGADT7相連，構(gòu)建重組子pGAD-NB15、pGAD-NW1。將pGAD-NB15和pGAD-NW1分別與構(gòu)建好的重組子誘餌質(zhì)粒pGBK-NSvc4、pGBK-CP、pGBK-SP兩兩共轉(zhuǎn)化到酵母菌AH109中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于不同的營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基平板，從而檢測(cè)NB15和NW1全長(zhǎng)基因表達(dá)產(chǎn)物與RSV CP、SP和NSvc4的互作情況。結(jié)果表明蛋白NB15、NW1均能與NSvc

4、4蛋白發(fā)生互作，與CP、SP均不能產(chǎn)生互作。 設(shè)計(jì)特異引物，利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)水稻基因NB15與NW1的mRNA在健康水稻葉片和受RSV侵染的水稻葉片中的表達(dá)量情況。比較mRNA的表達(dá)量差異，從而分析RSV侵染及病毒蛋白與寄主蛋白互作對(duì)mRNA的影響。結(jié)果表明，NB15的mRNA在RSV侵染后的水稻中與在健康水稻中的表達(dá)量相比表現(xiàn)為下調(diào)；NW1的mRNA表達(dá)量在RSV侵染后的水稻中與在健康水稻中的表達(dá)量相比表現(xiàn)為上調(diào)。

5、 構(gòu)建了水稻基因NB15的融合蛋白原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌(Escherichia coil)BL21中得以表達(dá)，SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)測(cè)定融合蛋白的分子量約為27KDa。割膠純化蛋白，分多次間隔免疫健康公家兔，制備了His-NB15抗血清，運(yùn)用ELISA技術(shù)檢測(cè)其效價(jià)(1：12800)，并通過(guò)Western-blot印跡表明，它與水稻葉片總蛋白有很強(qiáng)的免疫性，但健康水稻中檢測(cè)NB15較病葉中的含量低：制

6、備的NBl5抗血清，可用于后續(xù)的免疫膠體金及細(xì)胞定位研究。 研究水稻條紋病毒基因組RNA編碼的NS3蛋白與其他基因組分編碼的蛋白SP、CP、NSvc4之間的互作。RT-PCR擴(kuò)增目的基因NS3，構(gòu)建酵母表達(dá)載體，將其分別與酵母誘餌載體pGBKT7與酵母捕獲載體pGADT7相連，得到重組子pGAD-NS3、pGBK-NS3。自身毒性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NS3蛋白對(duì)酵母細(xì)胞無(wú)毒性和自身激活活性，也不存在自身互作。將這兩個(gè)重組子分別與CP