水稻病毒與介體互作研究及水稻條紋病毒編碼蛋白功能研究.pdf

1、水稻病毒病是水稻生產(chǎn)上一類重要的病害，廣泛發(fā)生在我國水稻種植的地區(qū)。水稻病毒主要由稻飛虱等昆蟲介體傳播。伴隨著稻飛虱的爆發(fā)，水稻病毒病流行危害，對(duì)糧食生產(chǎn)造成了極大威脅。本研究中探索了水稻病毒和其傳播介體之間的聯(lián)系;研究了水稻條紋病毒（Rice stripe virus，RSV）的沉默抑制子和運(yùn)動(dòng)蛋白兩個(gè)關(guān)鍵蛋白的作用機(jī)制，旨在為更好地防治水稻病毒的危害提供幫助。
　　 1白背飛虱轉(zhuǎn)錄組及感染SRBSDV后基因表達(dá)差異比較

2、>　　 運(yùn)用新一代測(cè)序技術(shù)，構(gòu)建了白背飛虱攜帶南方黑條矮縮病毒（Southern riceblack-streaked dwarf virus, SRBS DV）以及不帶毒的文庫，比較了帶毒以后介體白背飛虱的基因表達(dá)的差異。得到了白背飛虱81388個(gè)不同的Unigene;通過和已報(bào)道的灰飛虱和褐飛虱轉(zhuǎn)錄組信息比較，發(fā)現(xiàn)三者具有非常類似的基因功能分類。通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)在白背飛虱里存在7291個(gè)簡(jiǎn)單重復(fù)序列。通過比較帶毒后和不帶毒白

3、背飛虱基因表達(dá)的差異，發(fā)現(xiàn)SRBSDV感染介體白背飛虱后會(huì)影響其初級(jí)代謝以及泛素化介導(dǎo)的蛋白酶降解途徑，發(fā)現(xiàn)5.5％細(xì)胞骨架系統(tǒng)相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生了變化，還發(fā)現(xiàn)白背飛虱的免疫系統(tǒng)及RNA干擾途徑隨著病毒的侵染會(huì)被激活。研究結(jié)果首次闡述了呼腸孤病毒科植物病毒與其介體之間的關(guān)系，為研究水稻重要病害的傳播以及致病機(jī)制提供了依據(jù)。
　　 2 RSV編碼的NS3蛋白的灰飛虱互作蛋白R(shí)PN3的鑒定
　　 構(gòu)建了灰飛虱的cDNA文庫，

4、采用酵母雙雜交的手段篩選到了一個(gè)26S蛋白酶系統(tǒng)的亞基RPN3能夠和NS3互作，并且通過體外Pull-down的試驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。NS3是病毒沉默抑制子，具有不依賴序列特異性的dsRNA結(jié)合活性，首先利用植物系統(tǒng)研究了RPN3對(duì)NS3沉默抑制功能的影響，發(fā)現(xiàn)兩者的互作對(duì)NS3沉默抑制子功能沒有影響。利用酵母系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)灰飛虱的RPN3能夠互補(bǔ)酵母RPN3突變的菌株的“活性”;當(dāng)同NS3一起轉(zhuǎn)化時(shí)，灰飛虱互補(bǔ)酵母突變型的能力大大下降，不僅影響了

5、總蛋白的泛素化水平，而且對(duì)其泛素化蛋白降解途徑的蛋白降解能力也有很大的破壞。推測(cè)NS3和RPN3互作直接影響了RPN3參與形成蛋白酶復(fù)合體的能力?？寺×薘PN3的一個(gè)433位氨基酸由異亮氨酸(I)突變?yōu)樘K氨酸(T)的點(diǎn)突變體，該突變不能和NS3互作，但是不影響其互補(bǔ)酵母RPN3突變體的能力。當(dāng)突變體RPN3和NS3共同轉(zhuǎn)化到酵母突變體時(shí)，NS3對(duì)其互補(bǔ)突變體活性的影響不大，為NS3通過互作影響RPN3功能提供了直接證據(jù)。發(fā)現(xiàn)當(dāng)利用dsR

6、NA介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)使RPN3基因表達(dá)受到抑制時(shí)，帶毒的灰飛虱體內(nèi)病毒含量會(huì)逐漸上升，說明蛋白酶系統(tǒng)是抵抗RSV的一個(gè)重要方式。當(dāng)沉默RPN3后，灰飛虱會(huì)因?yàn)轶w內(nèi)病毒含量上升而增加傳毒能力。
　　 突變體分析發(fā)現(xiàn)NS3能夠和RPN3的C段互作，這種互作不僅需要26S蛋白酶調(diào)控亞基的C末端保守區(qū)域還需要PCI domain的末端一部分。我們發(fā)現(xiàn)的433位異亮氨酸(I)突變?yōu)樘K氨酸(T)的點(diǎn)突變體即位于RPN3的C末端。在江蘇鹽城

7、分離的灰飛虱中發(fā)現(xiàn)存在RPN3433位異亮氨酸(I)突變?yōu)樘K氨酸(T)的點(diǎn)突變體，說明在自然進(jìn)化中該類點(diǎn)突變是有意義的。泛素化蛋白酶系統(tǒng)是生物最重要的系統(tǒng)，RSV編碼的NS3蛋白能夠通過直接和RPN3互作而影響其功能，從而有利于病毒自身，但是對(duì)灰飛虱來說病毒的過度繁殖是不利的。因此在長(zhǎng)期進(jìn)化中，RSV高發(fā)地區(qū)選擇壓造成灰飛虱進(jìn)化出一些逃避機(jī)制，本研究在灰飛虱中發(fā)現(xiàn)的RPN3點(diǎn)突變即是寄主在不影響蛋白酶功能的基礎(chǔ)上逃避RSV不利影響的重要

8、方式。
　　 3 RSV在三種寄主中產(chǎn)生小RNA的多樣性分析及介體灰飛虱中存在RNA干擾介導(dǎo)的抗病毒的證實(shí)
　　 小RNA介導(dǎo)的基因沉默在植物以及無脊椎動(dòng)物抵抗病毒侵染中發(fā)揮了重要作用。之前已經(jīng)有很多植物病毒侵染寄主植物后產(chǎn)生小RNA的報(bào)道，但是沒有同一種植物病毒侵染植物寄主以及在傳播介體昆蟲中產(chǎn)生小RNA的多樣性的報(bào)道。
　　 水稻條紋病毒(RSV)除了能夠在水稻及傳播介體灰飛虱中復(fù)制外，還能夠系統(tǒng)侵染本氏煙。

9、運(yùn)用大規(guī)模深度測(cè)序的方法研究了RSV侵染傳播介體灰飛虱，水稻以及本氏煙后在三種寄主中產(chǎn)生小RNA的群體差異情況。還首次克隆了灰飛虱中RNA干擾相關(guān)的原件如Dicers和Agronautes，并發(fā)現(xiàn)這些元件在三種稻飛虱中都很保守，揭示了該基因家族在昆蟲進(jìn)化中的功能保守性。運(yùn)用雙鏈RNA顯微注射沉默基因的方法，發(fā)現(xiàn)當(dāng)沉默Ago2基因表達(dá)后，RSV在灰飛虱中積累上升，為RNA干擾在介體灰飛虱抵抗RSV中發(fā)揮重要作用提供了直接證據(jù)。
　　

10、 4 RSV NSvc4在本氏煙胞間運(yùn)動(dòng)及在癥狀形成中的作用
　　 RSV編碼的NSvc4是該病毒的運(yùn)動(dòng)蛋白。為了更好的了解該運(yùn)動(dòng)蛋白的定位性質(zhì)以及運(yùn)動(dòng)機(jī)制，對(duì)該蛋白進(jìn)行了深入地研究。
　　 發(fā)現(xiàn)NSvc4蛋白是利用寄主的微絲系統(tǒng)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)到達(dá)胞間連絲(PD)，當(dāng)用Lat B和BFA分別破壞本氏煙的微絲和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)后，瞬時(shí)表達(dá)NSvc4-GFP，到達(dá)胞間連絲的點(diǎn)刻狀顆粒明顯減少，而破壞微管后基本上對(duì)胞間連絲定位沒有

11、影響。當(dāng)用化學(xué)藥劑Lat B破壞本氏煙的微絲后，RSV侵染本氏煙的效率明顯降低，證實(shí)了微絲系統(tǒng)而不是微管在RSV侵染寄主中發(fā)揮重要作用。通過軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)NSvc4的106到125區(qū)域有一個(gè)跨膜的結(jié)構(gòu)域，當(dāng)突變?cè)搮^(qū)域后NSvc4到達(dá)PD的數(shù)量明顯減少，有很多點(diǎn)顆狀的聚集體在胞內(nèi)聚集，說明跨膜結(jié)構(gòu)對(duì)NSvc4運(yùn)動(dòng)是必需的，也證實(shí)了NSvc4到達(dá)PD需要通過細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)的運(yùn)輸。
　　 除了在胞間連絲發(fā)現(xiàn)有定位外，也發(fā)現(xiàn)NSvc4也能定

12、位到葉綠體以及葉綠體外周;突變體分析發(fā)現(xiàn)NSvc4的N端1-73個(gè)氨基酸就足以使MP定位在葉綠體。當(dāng)NSvc4在PVX表達(dá)載體上表達(dá)浸潤(rùn)本氏煙后，會(huì)比對(duì)照產(chǎn)生更嚴(yán)重的花葉以及壞死等現(xiàn)象;電鏡觀察發(fā)現(xiàn)其侵染的植物葉綠體膜有褶皺和突起，葉綠體膜受到了破壞。突變體分析發(fā)現(xiàn)NSvc4產(chǎn)生癥狀的區(qū)域和葉綠體定位沒有直接關(guān)聯(lián)。另外，將NSvc4在昆蟲細(xì)胞（Spodoptera frugiperda9，sf-9）中表達(dá)發(fā)現(xiàn)其主要定位在細(xì)胞外周;不能產(chǎn)

13、生管狀結(jié)構(gòu)，說明其運(yùn)動(dòng)方式和其進(jìn)化上相近的另外一種負(fù)義植物病毒番茄斑萎病毒存在差異。
　　 5 RSV沉默抑制子NS3蛋白抑制基因沉默機(jī)理研究
　　 RSV編碼的NS3是沉默抑制子，但是還不清楚NS3蛋白是通過何種方式發(fā)揮沉默抑制作用的。已發(fā)現(xiàn)一些抑制子蛋白質(zhì)中一些帶正電荷的氨基酸能夠以靜電吸引結(jié)合具有磷酸基團(tuán)負(fù)電荷的核酸分子（如siRNA），從而阻斷基因沉默路徑，為了驗(yàn)證NS3結(jié)合siRNA的能力與基因沉默抑制功能之間

14、的聯(lián)系以及明確NS3結(jié)合siRNA的區(qū)域，將NS3蛋白中保守位點(diǎn)的11個(gè)帶正電荷氨基酸突變?yōu)楦拾彼岬炔粠щ姾傻陌被幔缓髽?gòu)建到植物表達(dá)載體中和野生型NS3分別浸潤(rùn)普通本氏煙和轉(zhuǎn)基因本氏煙16c上驗(yàn)證抑制子活性。發(fā)現(xiàn)抑制子的活性與NS3蛋白結(jié)合siRNA能力大小密切相關(guān)，將173-175的KKR突變了為AAA后，NS3結(jié)合siRNA的能力下降1000倍，在植物體內(nèi)NS3的沉默抑制功能幾乎完全消失。證實(shí)了NS3蛋白是通過劫持siRNA干擾