TNF-α對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中NO和eNOS的影響.pdf

1、目的:和背景：血管內(nèi)皮細(xì)胞(Vascularendothelialcell，VEC)是機(jī)體中一類重要的細(xì)胞群體，具有分泌、合成、代謝和免疫等多種功能。它在體內(nèi)廣泛分布，形成血液和組織之間的界面，不僅與血管張力、血管通透性和凝血密切相關(guān)，而且通過產(chǎn)生促炎癥細(xì)胞因子及與循環(huán)白細(xì)胞相互作用在炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷是炎癥伴隨的一個(gè)重要組織損傷反應(yīng)，許多由巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞本身產(chǎn)生的炎癥因子，比如腫瘤壞死

2、因子-α(tumornecrosisfactorα,TNF-α)、干擾素γ(interferonγ，IFNγ)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)都會(huì)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞造成損傷。內(nèi)皮損傷必然導(dǎo)致內(nèi)皮功能失調(diào)。內(nèi)皮功能失調(diào)表現(xiàn)為一氧化氮(nitricoxide,NO)產(chǎn)生量的異常。NO是由一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase，NOS)從L-精氨酸合成的自由基，是一種高反應(yīng)的小分子。NO執(zhí)行重要的生物功能，包括

3、擴(kuò)張血管、抗血小板聚集、抑制平滑肌細(xì)胞增殖等，然而，在炎癥性疾病中存在細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生過多的一氧化氮，又會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致內(nèi)皮受損。而一氧化氮合酶是NO產(chǎn)生過程中的限速酶，因此NOS的酶活性及其表達(dá)量直接影響到NO的產(chǎn)量。生物組織中已經(jīng)確定的NOS亞型有3種：神經(jīng)元型NOS(nNOS或NOS1)、內(nèi)皮型NOS(eNOS或NOS3)、誘導(dǎo)型NOS(iNOS或NOS2)，前兩者又稱為結(jié)構(gòu)型NOS(cNOS)。TNF-α參與內(nèi)皮細(xì)胞凋亡或者

4、壞死的確切機(jī)制尚不明確，它抑制內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelialnitricoxidesynthase，eNOS)激活誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase，iNOS)，從而影響一氧化氮(nitricoxide，NO)的合成和釋放，可能是其發(fā)揮細(xì)胞毒性作用造成組織損傷的重要原因。目前關(guān)于TNF-α對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞NO生成的作用尚存在爭(zhēng)論，多項(xiàng)研究由于所用的內(nèi)皮細(xì)胞類型和劑量不同，發(fā)現(xiàn)TNF-α對(duì)N

5、O產(chǎn)生結(jié)果有所不同。但是以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilicalveinendothelialcells,HUVEC)為介質(zhì)來研究TNF-α與NO及NOS之間的相關(guān)性目前尚鮮有報(bào)道。本研究即以HUVEC為實(shí)驗(yàn)材料，檢測(cè)不同濃度TNF-α作用不同時(shí)間后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞中NO水平的變化，以及細(xì)胞eNOS活性的改變，從而討論TNF-α對(duì)HUVEC中NO產(chǎn)生的影響及NOS調(diào)節(jié)的分子機(jī)制。 材料和方法所用細(xì)胞為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)

6、胞，0.1％Ⅰ型膠原酶，37℃消化30min，離心，沉淀用M199培養(yǎng)基(含15％胎牛血清，10ng/mlEGF)重懸，置于37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)孵育。內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)至80％融合，用含2％血清培養(yǎng)基孵育24h后用于實(shí)驗(yàn)，各組細(xì)胞設(shè)立3個(gè)復(fù)孔。(1)空白對(duì)照組：不加藥物處理的正常生長(zhǎng)的HUVECs；(2)不同濃度TNF-α處理組：分別用2ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，15ng/ml，20ng/ml的TNF-α作用24h；(

7、3)不同時(shí)間TNF-α處理組：用10ng/ml的TNF-α分別作用3h，6h，12h，24h，48h；(4)L-NMMA預(yù)處理組：加TNF-α之前用1mM的L-NMMA預(yù)處理1h；(5)DXM預(yù)處理組：加TNF-α之前用1uM的DXM預(yù)處理1h。Ⅰ型膠原酶和M199培養(yǎng)基購于Gibco公司，胎牛血清購于Hyclone公司，重組人內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(EndothelialGrowthFactor,EGF)(236-EG)購于R&D公司，NOS抑

8、制劑(NG-minomethyl-L-arginine，L-NMMA)購于Sigma公司，地塞米松(Dexamethasone，DXM)購于仙居制藥，TNF-α購于Pepretech公司，兔抗人八因子抗體(ZA-0111)購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，NO和NOS活性測(cè)定試劑盒及考馬斯亮藍(lán)試劑盒購于南京建成生物技術(shù)公司。 細(xì)胞經(jīng)藥物作用后，收集細(xì)胞上清，儲(chǔ)存于-80℃冰箱中，以備測(cè)定NO之用。貼壁的細(xì)胞先用PBS洗一遍，加0

9、.25％胰酶消化5分鐘，收集細(xì)胞懸液，1000rpm離心10min，棄上清，加入300u1的生理鹽水，用超聲波細(xì)胞粉碎儀粉碎細(xì)胞，用于NOS活性的測(cè)定；用于測(cè)定NO的細(xì)胞裂解液可先保存于-80℃冰箱中。用考馬斯亮藍(lán)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。參照NO試劑盒提供的說明書操作，用硝酸酶還原法分別測(cè)定細(xì)胞上清中和細(xì)胞裂解液中的NO含量；參照NOS活性試劑盒提供的說明書操作，分別測(cè)定細(xì)胞裂解液中總NOS和iNOS的活性，并按公式計(jì)算細(xì)胞裂解液中eNOS

10、的活性 數(shù)據(jù)全部用-x±s表示，用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，P＜0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果:1.不同濃度TNF-α干預(yù)HUVEC后eNOS活性及NO含量的變化分別用2ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，15ng/ml，20ng/ml的TNF-α干預(yù)HUVEC24h，之后測(cè)定細(xì)胞裂解液中eNOS活性和NO含量，及細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO含量，發(fā)現(xiàn)隨著TNF-α濃度的升高，eNOS的

11、活性逐漸減弱(P＜0.01)，而細(xì)胞中NO的含量到TNF-α濃度加到15ng/ml時(shí)NO含量明顯升高(P＜0.05)；另外細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO含量在用較低濃度TNF-α干預(yù)時(shí)就有所升高(P＜0.05)，隨著濃度增加進(jìn)一步上升(P＜0.01)。 2.用TNF-α干預(yù)HUVEC不同時(shí)間后eNOS活性及NO含量的變化干預(yù)用濃度為10ng/ml的TNF-α分別預(yù)HUVEC3h，6h，12h，24h，48h，以同時(shí)間點(diǎn)未加藥的空白組作對(duì)照，

12、同樣測(cè)定細(xì)胞裂解液中eNOS活性和NO含量，及細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO含量，發(fā)現(xiàn)盡管用TNF-α干預(yù)后與對(duì)照組無顯著差異，但是隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)eNOS的活性還是明顯減弱的(P＜0.05)；而細(xì)胞中NO的含量在較短時(shí)間內(nèi)無明顯差異，但是大于24h后其表達(dá)量升高(P＜0.05)，且明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)；另細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO含量也有與細(xì)胞中相似的變化。3.L-NMMA及DXM對(duì)TNF-α干預(yù)HUVEC后NO含量的影響在用10ng/ml的