microRNA在TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中作用及機(jī)制的研究.pdf

1、研究目的：(1)建立原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)體外培養(yǎng)方法并探討TNF-α對(duì)HUVEC凋亡程度的影響,篩選出TNF-α誘導(dǎo)凋亡的最佳作用濃度和時(shí)間;(2)探討TNF-α誘導(dǎo)凋亡的HUVECmicroRNA的差異表達(dá)譜,驗(yàn)證在TNF-α誘導(dǎo)HUVEC凋亡中顯著差異表達(dá)的microRNA;(3)根據(jù)篩選結(jié)果,探討microRNA-23a在HUVEC凋亡中的調(diào)節(jié)功能。(4)研究microRNA-23a在TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的

2、作用機(jī)制,為對(duì)抗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的治療途徑提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 研究方法：實(shí)驗(yàn)分為四個(gè)部分：(1)原代細(xì)胞培養(yǎng)參照文獻(xiàn)報(bào)道方法并加以改進(jìn),通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和免疫細(xì)胞化學(xué)法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定;然后用不同濃度TNF-α(0、1ng/ml、10ng/ml、40ng/ml、100ng/ml)處理內(nèi)皮細(xì)胞不同時(shí)間(0、12h、24h、48h),通過(guò)電鏡,Hoechst33258熒光染色,TUNEL法,實(shí)時(shí)熒光定量PCR及western blo

3、t檢測(cè)HUVEC的凋亡程度,確定TNF-α能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的最佳作用濃度和時(shí)間;(2)采用laParafloTM microRNA芯片技術(shù),將4例空白對(duì)照標(biāo)本與4例TNF-α(10ng/ml,24h)誘導(dǎo)凋亡的HUVEC標(biāo)本的microRNA進(jìn)行比對(duì),根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)的有關(guān)方法分析芯片實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),篩選出共同差異表達(dá)的候選microRNA;并采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR的方法,分別驗(yàn)證這些候選microRNA的差異表達(dá)情況。將芯片和熒光實(shí)時(shí)定量PC

4、R兩種方法結(jié)論一致的候選microRNA確定為有意義的共同差異表達(dá)microRNA;(3)采用microRNA-23a抑制劑(LNA-anti-miR-23a,50nmol/L)和microRNA-23a前體(Pre-miR-23a,50nmol/L)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HUVEC使內(nèi)皮細(xì)胞抑制或過(guò)表達(dá)microRNA-23a,設(shè)立空白對(duì)照組,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。隨后用TNF-α干預(yù)轉(zhuǎn)染后的HUVEC,通過(guò)Hoechst33258熒

5、光染色,TUNEL染色,實(shí)時(shí)熒光定量PCR及western blot等方法檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組HUVEC的凋亡程度改變;(4)使用miRanda,picTar和Targetscan軟件分析,結(jié)合文獻(xiàn)查詢和基因芯片研究結(jié)果,預(yù)測(cè)與凋亡相關(guān)的microRNA-23a的靶基因;用microRNA抑制劑轉(zhuǎn)染HUVEC使microRNA-23a表達(dá)水平下調(diào),并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和Western blot法觀察其是否引起靶基因表達(dá)增多。

6、r>　　 研究結(jié)果：(1)經(jīng)相差顯微鏡觀察以及Ⅷ因子染色證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞(97.5％)為HUVEC,臺(tái)盼藍(lán)染色顯示95％以上細(xì)胞存活良好;TNF-α呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性引起HUVEC凋亡;(2)TNF-α(10 ng/ml)處理HUVEC24h后,芯片結(jié)果示microRNA表達(dá)譜有明顯變化,其中有12個(gè)microRNA表達(dá)上調(diào),9個(gè)microRNA表達(dá)下調(diào);實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果證實(shí)miRNA-23a,miRNA-126表達(dá)顯著減少

7、;(3)Hoechst33258熒光染色,TUNEL染色,實(shí)時(shí)熒光定量PCR及western blot結(jié)果顯示：microRNA-23a抑制劑使TNF-α誘導(dǎo)的HUVEC凋亡數(shù)量明顯增多;microRNA-23a過(guò)表達(dá)使得TNF-α誘導(dǎo)的HUVEC凋亡數(shù)量明顯減少。(4)經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)APAF-1,caspase-7和STK4可能是microR-23a的3個(gè)候選靶基因,并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot證實(shí)mic

8、roRNA-23a抑制劑組該3個(gè)靶基因的表達(dá)有顯著性升高。
　　 研究結(jié)論：(1)本研究在成功建立HUVEC體外培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上,建立了TNF-α誘導(dǎo)HUVEC凋亡的模型,確立TNF-α能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的最佳作用濃度為10ng/ml,時(shí)間為24h;(2)運(yùn)用microRNA芯片技術(shù),首次發(fā)現(xiàn)TNF-α誘導(dǎo)凋亡的內(nèi)皮細(xì)胞中microRNA-23a表達(dá)明顯減少,microRNA-126表達(dá)也有明顯下調(diào)。這為進(jìn)一步研究microR