miRNA-720對TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制.pdf

1、研究目的：1.建立原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)體外培養(yǎng)的方法，討論TNF-α對該細(xì)胞凋亡程度的影響;2.根據(jù)發(fā)表的論文中相同篩選方式的結(jié)果，探討miRNA-720在HUVEC凋亡中的調(diào)節(jié)功能;3.研究miRNA-720對細(xì)胞凋亡影響的機(jī)制。
　　研究方法：本實(shí)驗分為三部分:1原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法參考相關(guān)文獻(xiàn)報道并加以改進(jìn)，通過觀察細(xì)胞形態(tài)和利用免疫細(xì)胞化學(xué)法對細(xì)胞進(jìn)行鑒定;用四種方法(電鏡觀察，Hoechst33258熒光染色

2、，TUNEL法以及western blot)檢測HUVEC的凋亡程度;2參考文獻(xiàn)中有關(guān)芯片檢測結(jié)果，選定miRNA-720為有意義的共同差異表達(dá)microRNA。采用miRNA-720前體(pre-miR-720)瞬時轉(zhuǎn)染HUVEC從而使得內(nèi)皮細(xì)胞抑制或者過表達(dá)該microRNA，設(shè)立空白對照組，用實(shí)時熒光定量PCR法檢測轉(zhuǎn)染的效率。然后用TNF-α干預(yù)轉(zhuǎn)染后的HUVEC，再次通過Hoechst33258熒光染色、TUNEL法、實(shí)時定量

3、PCR法以及western blot等方法檢測不同轉(zhuǎn)染組與對照組的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡程度改變;3使用生物信息學(xué)軟件分析，結(jié)合文獻(xiàn)查詢，預(yù)測與凋亡相關(guān)的miR-720的靶基因;用熒光素酶報告基因法驗證DNMT3A是否為miR-720作用的靶基因;用miRNA-720抑制劑轉(zhuǎn)染HUVEC，采用實(shí)時熒光定量PCR法和western blot觀察其是否引起靶基因表達(dá)增多;用DNA Methylation PCR檢測細(xì)胞內(nèi)基因甲基化的變化。
　　

4、研究結(jié)果：(1)經(jīng)相差顯微鏡觀察以及Ⅷ因子染色證明培養(yǎng)的細(xì)胞中98％為HUVEC，臺盼藍(lán)染色顯示95％以上細(xì)胞的存活狀態(tài)良好，TNF-α能引起HUVEC凋亡;(2) Hoechst33258熒光染色，TUNEL染色，實(shí)時熒光定量PCR及western blot結(jié)果顯示: miRNA-720抑制劑使得TNF-α誘導(dǎo)的HUVEC凋亡數(shù)量明顯減少，而miRNA-720的過表達(dá)使得TNF-α誘導(dǎo)的HUVEC凋亡數(shù)明顯增加;(3)經(jīng)過生物信息學(xué)軟

5、件的分析預(yù)測，DNMT3A很有可能是miRNA-720的候選靶基因，經(jīng)過熒光素酶報告基因法，實(shí)時定量PCR，Western blot和MSP證實(shí)miRNA-720抑制組該基因的表達(dá)有顯著提升。
　　研究結(jié)論：(1)本研究以成功建立HUVEC體外培養(yǎng)方法為基礎(chǔ)，建立了TNF-α誘導(dǎo)HUVEC凋亡的實(shí)驗?zāi)Ｐ?(2) miRNA-720在TNF-α誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞凋亡中表達(dá)明顯上升，能明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡，破壞細(xì)胞生存。(3) miRN