馬兜鈴酸Ⅰ對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響及其機(jī)制.pdf

1、研究背景：馬兜鈴酸(Aristolochic acid, AA)是馬兜鈴科馬兜鈴屬植物中的一類菲類化合物，具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫功能和提升白細(xì)胞等作用，曾應(yīng)用廣泛。但90年代開(kāi)始，因服用含AA的藥物所致的“馬兜鈴酸腎病”(Aristolchic acid nephropathy,AAN)、腎小管間質(zhì)纖維化在國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)界受到廣泛的關(guān)注。目前的研究主要是在AA引起的腎小管上皮細(xì)胞的損傷以致腎小管間質(zhì)纖維化，近幾年微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)

2、化(endothelial-mesenchymal transition，Endo MT)與腎小管間質(zhì)纖維化的關(guān)系越來(lái)越受到研究者的重視，但是AA對(duì)腎微血管內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及其免疫機(jī)制研究較少。 目的：本試驗(yàn)應(yīng)用馬兜鈴酸Ⅰ(AAI)作用于體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，觀察馬兜鈴酸Ⅰ對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、調(diào)亡、分泌、轉(zhuǎn)分化方面的影響，探討其與共刺激分子CD40/CD40L、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)/TGF-β

3、Ⅱ型受體( TGF-βⅡR)之間的關(guān)系，為馬兜鈴酸腎病血管內(nèi)皮轉(zhuǎn)化和免疫發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。 方法： 1.MTT比色法：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)的HUVEC接種到96孔板，加入不同濃度(5、10、20、40、80μg/mL)的馬兜鈴酸Ⅰ刺激96小時(shí)，檢測(cè)馬兜鈴酸Ⅰ對(duì)HUVEC增殖的影響。 2.流式細(xì)胞儀(FCM)：將HUVEC經(jīng)不同濃度(10、20、40、80μg/mL)的馬兜鈴酸Ⅰ刺激96小時(shí)，檢測(cè)馬兜鈴酸Ⅰ對(duì)HU

4、VEC調(diào)亡的影響。 3.將HUVEC經(jīng)不同濃度(10、20、40μg/mL)的馬兜鈴酸Ⅰ刺激96小時(shí)，通過(guò)FCM檢測(cè)正常血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志分子VEGFR(F1k1)，Western Blot的方法測(cè)定肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志蛋白平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)表達(dá)的變化。 4.將HUVEC經(jīng)不同濃度(10、20、40μg/mL)的馬兜鈴酸Ⅰ刺激96小時(shí)，分別通過(guò)FCM檢測(cè)CD40L表達(dá)，Western Blot的方法測(cè)定CD40量

5、的變化；同時(shí)分別通過(guò)FCM檢測(cè)TGF-βIIR，Western Blot的方法測(cè)定TGF-β1表達(dá)的變化。 5.酶聯(lián)免疫法：將HUVEC經(jīng)不同濃度(10、20、40μg/mL)的馬兜鈴酸Ⅰ分別刺激一、二、三、四、五天，檢測(cè)檢測(cè)馬兜鈴酸Ⅰ引起HUVEC分泌TGF-β1的變化。 結(jié)果：不同濃度馬兜鈴酸和HUVEC1培養(yǎng)96小時(shí)后，結(jié)果如下： 1.5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL組細(xì)胞增殖未受抑制，40μg

6、/mL組可見(jiàn)細(xì)胞增殖受到抑制，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，80μg/mL組細(xì)胞增殖明顯受到抑制(P<0.05)。 2.馬兜鈴酸I在10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL時(shí)均可引起HUVEC調(diào)亡，10μg/mL組無(wú)后三組引起HUVEC調(diào)亡明顯，20μg/mL、40μg/mL兩者間無(wú)明顯的差別，80μg/mL組較前兩組引起HUVEC調(diào)亡更明顯。 3.馬兜鈴酸I在20μg/mL、40μg/mL時(shí)正常血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)

7、志分子血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(F1k1)隨著馬兜鈴酸I刺激濃度增高表達(dá)下調(diào)，α-SMA隨著刺激濃度增加表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。 4.馬兜鈴酸I在20μg/mL、40μg/mL時(shí)均可引起HUVEC上CD40/CD40L、TGF-β1/TGF-βIIR表達(dá)，且隨著刺激濃度增加表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。馬兜鈴酸I在40μg/mL可明顯促進(jìn)TGF-β1的分泌(P<0.05)，而10μg/mL和20μg/mL組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

8、結(jié)論：綜上所述，本研究即采用體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，馬兜鈴酸I刺激后細(xì)胞的增殖和凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，馬兜鈴酸I可直接抑制細(xì)胞增殖，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)化，正常內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物F1k1的表達(dá)下調(diào)，肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志蛋白平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)共刺激分子CD40/CD40L、促纖維化細(xì)胞因子TGF-β1/TGF-βIIR的上調(diào)表達(dá)，提示馬兜鈴酸I可以通過(guò)激活共刺激分子CD40信號(hào)、纖維化細(xì)胞因子TGF-β1促使內(nèi)皮細(xì)胞向平