葡萄糖、TNF-α、IL-1β對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體表達(dá)影響的研究.pdf

1、目的研究高糖、TNF—Q和兒一1B對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV304)EPCRmRNA表達(dá)的影響，以及曲格列酮對(duì)高糖造成的內(nèi)皮細(xì)胞EPCRmRNA表達(dá)下調(diào)的影響。 方法通過(guò)體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV304)，待細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，2-3次／周換液。細(xì)胞生長(zhǎng)至80％-90％融合時(shí)，分別以FCM技術(shù)和RT-PCR技術(shù)證實(shí)ECV304細(xì)胞膜上有內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體(EPCR)蛋白水平和mRNA水平的表達(dá)。分別以含高糖、TNF．Q、IL

2、．1β和曲格列酮的培養(yǎng)基孵育ECV304細(xì)胞，行劑量和時(shí)間依賴(lài)性實(shí)驗(yàn)。采用real-timePCR技術(shù)測(cè)定ECV304EPCRmRNA的表達(dá)。 干預(yù)一：ECV304細(xì)胞用含D-葡萄糖的低血清(含3％小牛血清)RPMI．1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，觀察不同D一葡萄糖濃度(5mmol／L、10mmol／L、30mmol／L、50mmol／L)時(shí)EPCRmRNA的表達(dá)；同時(shí)以D．葡萄糖濃度為50mmol／L的低血清(含3％小牛血清)RP

3、MI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)ECV304細(xì)胞，觀察不同時(shí)間點(diǎn)(0．5h、3h、6h、12h、24h)時(shí)EPCRmRNA的表達(dá)。以相同時(shí)間的不加刺激劑組為對(duì)照。 干預(yù)二：ECV304細(xì)胞用含TNF．α的低血清(含3％小牛血清)RPMI．1640培養(yǎng)基培養(yǎng)12h，觀察不同濃度TNF—α(2ng／ml、10ng／ml、25ng／m1)時(shí)EPCRmRNA的表達(dá)；同時(shí)以含TNF．Q10ng／ml的低血清(含3％小牛血清)RPMI．1640培養(yǎng)

4、基培養(yǎng)ECV304細(xì)胞，觀察不同時(shí)間點(diǎn)(1h、3h、6h、12h)時(shí)EPCRmRNA的表達(dá)。以相同時(shí)間的不加刺激劑組為對(duì)照。 干預(yù)三：ECV304細(xì)胞用含IL．1B的低血清(含3％小牛血清)RPMI一1640培養(yǎng)基培養(yǎng)12h，觀察不同濃度IL-lβ(5ng／ml、10ng／ml、20ng／m1)時(shí)EPCRmRNA的表達(dá)；同時(shí)以含IL—lB10ng/ml的低血清(含3％小牛血清)RPMI—1640培養(yǎng)基培養(yǎng)ECV304細(xì)胞，觀察不

5、同時(shí)間點(diǎn)(0．5h、3h、6h、12h)時(shí)EPCRmRNA的表達(dá)。以相同時(shí)間的不加刺激劑組為對(duì)照。 干預(yù)四：ECV304細(xì)胞先以含不同濃度(5gmol／L、10~tmol／L、20~tmol／L)曲格列酮的低血清(含3％小牛血清)RPMI．1640培養(yǎng)基培養(yǎng)6h，然后置于含50mmol／L葡萄糖的新鮮低血清(含3％小牛血清)RPMI一1640培養(yǎng)基中孵育至24h。同時(shí)以相同時(shí)間的不加刺激劑組為空白對(duì)照，以相同時(shí)間含50mmol／

6、L葡萄糖的低血清(含3％小牛血清)RPMI一1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24h組為陽(yáng)性對(duì)照。觀察不同處理情況下ECV304細(xì)胞EPCRmRNA的表達(dá)。 結(jié)果1．不同濃度D．葡萄糖孵育ECV304細(xì)胞24h，在D．葡萄糖濃度分別為5、10、30、50mmol／L時(shí)其EPCRmRNA的表達(dá)分別為(93．58~0．96)％(p>0．05)、(91．42±0．13)％(p>O．05)、(85．14+0．56)％(p<0．05)和(65．02+0．

7、62)％(p<0．01：(與空白對(duì)照組比)；以含50mmol／LD-葡萄糖的培養(yǎng)基分別孵育ECV304細(xì)胞0．5、3、6、12、24h，其EPCRmRNA的表達(dá)分別為(95．68-4-0．76)％、(92．58~0．58]％、(95．62~0．56)％、(82．96~0．89)％(P<0．05)和(64．78~0．86)％(P<0．01)(與空白對(duì)照組比)。 2．不同濃度TNF-Q孵育ECV304細(xì)胞12h，在TNF．α濃度分別

8、達(dá)2ng／ml、10ng／ml、25ng／ml時(shí)EPCRmRNA的表達(dá)分別是對(duì)照組(100％)的(48．28~0．95)％(P<0．01)、(35．54~0．87)％(P<0．01)和(25．42~0．50)％(P

9、0．61)％(P<0．05)和(35．54~0．87)％(P<0．01)(與空白對(duì)照組比)。 3．不同濃度IL一1B孵育ECV304細(xì)胞12h，在IL．1B濃度分別達(dá)5ng／ml、10ng／ml、20ng／ml時(shí)EPCRmRNA的表達(dá)分別是對(duì)照組(100％)的(40．70~0．98)％(P<0．01)、(34．44~0．56)％(P<0．01)和(10．74~0．36)％(P

10、孵育ECV304細(xì)胞0．5、3、6、12h，其EPCRmRNA的表達(dá)分別為(61．68~0．59)％(P

11、的培養(yǎng)基孵育ECV304細(xì)胞至24h。同時(shí)以相同時(shí)間的不加刺激劑組為空白對(duì)照，以相同時(shí)間的含50mmol／LD一葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24h組為陽(yáng)性對(duì)照組。其中陽(yáng)性對(duì)照組EPCRmRNA的表達(dá)為(65．50~0．81)％，曲格列酮濃度分別為5pmol／L、10~mol／L、20pmol／L預(yù)處理ECV304細(xì)胞6h后EPCRmRNA的表達(dá)分別為(72．82~0．46)％、(82．60~0．57)％和(61．86土1．59)％(與空白對(duì)照

12、組比)。 結(jié)論1．EPCR在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV304)上高表達(dá)。高糖、TNF．Q和IL-1β可以下調(diào)ECV304細(xì)胞EPCRmRNA的表達(dá)，因此EPCR可以作為內(nèi)皮細(xì)朐受損的標(biāo)志物； 2．目前研究發(fā)現(xiàn)EPCR在體內(nèi)主要發(fā)揮抗凝和參與炎癥反應(yīng)的作用，國(guó)外研究表明TNF-α、IL-1β可以下調(diào)ECV304細(xì)胞EPCRmRNA的表達(dá)，但國(guó)內(nèi)尚無(wú)相關(guān)研究。本研究在國(guó)內(nèi)首次證實(shí)高糖、TNF．Q和IL．1β在劑量和時(shí)間依賴(lài)水平