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1、目的研究高糖、TNF—Q和兒一1B對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV304)EPCRmRNA表達(dá)的影響,以及曲格列酮對(duì)高糖造成的內(nèi)皮細(xì)胞EPCRmRNA表達(dá)下調(diào)的影響。 方法通過(guò)體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV304),待細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,2-3次/周換液。細(xì)胞生長(zhǎng)至80%-90%融合時(shí),分別以FCM技術(shù)和RT-PCR技術(shù)證實(shí)ECV304細(xì)胞膜上有內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體(EPCR)蛋白水平和mRNA水平的表達(dá)。分別以含高糖、TNF.Q、IL
2、.1β和曲格列酮的培養(yǎng)基孵育ECV304細(xì)胞,行劑量和時(shí)間依賴(lài)性實(shí)驗(yàn)。采用real-timePCR技術(shù)測(cè)定ECV304EPCRmRNA的表達(dá)。 干預(yù)一:ECV304細(xì)胞用含D-葡萄糖的低血清(含3%小牛血清)RPMI.1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24h,觀察不同D一葡萄糖濃度(5mmol/L、10mmol/L、30mmol/L、50mmol/L)時(shí)EPCRmRNA的表達(dá);同時(shí)以D.葡萄糖濃度為50mmol/L的低血清(含3%小牛血清)RP
3、MI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)ECV304細(xì)胞,觀察不同時(shí)間點(diǎn)(0.5h、3h、6h、12h、24h)時(shí)EPCRmRNA的表達(dá)。以相同時(shí)間的不加刺激劑組為對(duì)照。 干預(yù)二:ECV304細(xì)胞用含TNF.α的低血清(含3%小牛血清)RPMI.1640培養(yǎng)基培養(yǎng)12h,觀察不同濃度TNF—α(2ng/ml、10ng/ml、25ng/m1)時(shí)EPCRmRNA的表達(dá);同時(shí)以含TNF.Q10ng/ml的低血清(含3%小牛血清)RPMI.1640培養(yǎng)
4、基培養(yǎng)ECV304細(xì)胞,觀察不同時(shí)間點(diǎn)(1h、3h、6h、12h)時(shí)EPCRmRNA的表達(dá)。以相同時(shí)間的不加刺激劑組為對(duì)照。 干預(yù)三:ECV304細(xì)胞用含IL.1B的低血清(含3%小牛血清)RPMI一1640培養(yǎng)基培養(yǎng)12h,觀察不同濃度IL-lβ(5ng/ml、10ng/ml、20ng/m1)時(shí)EPCRmRNA的表達(dá);同時(shí)以含IL—lB10ng/ml的低血清(含3%小牛血清)RPMI—1640培養(yǎng)基培養(yǎng)ECV304細(xì)胞,觀察不
5、同時(shí)間點(diǎn)(0.5h、3h、6h、12h)時(shí)EPCRmRNA的表達(dá)。以相同時(shí)間的不加刺激劑組為對(duì)照。 干預(yù)四:ECV304細(xì)胞先以含不同濃度(5gmol/L、10~tmol/L、20~tmol/L)曲格列酮的低血清(含3%小牛血清)RPMI.1640培養(yǎng)基培養(yǎng)6h,然后置于含50mmol/L葡萄糖的新鮮低血清(含3%小牛血清)RPMI一1640培養(yǎng)基中孵育至24h。同時(shí)以相同時(shí)間的不加刺激劑組為空白對(duì)照,以相同時(shí)間含50mmol/
6、L葡萄糖的低血清(含3%小牛血清)RPMI一1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24h組為陽(yáng)性對(duì)照。觀察不同處理情況下ECV304細(xì)胞EPCRmRNA的表達(dá)。 結(jié)果1.不同濃度D.葡萄糖孵育ECV304細(xì)胞24h,在D.葡萄糖濃度分別為5、10、30、50mmol/L時(shí)其EPCRmRNA的表達(dá)分別為(93.58~0.96)%(p>0.05)、(91.42±0.13)%(p>O.05)、(85.14+0.56)%(p<0.05)和(65.02+0.
7、62)%(p<0.01:(與空白對(duì)照組比);以含50mmol/LD-葡萄糖的培養(yǎng)基分別孵育ECV304細(xì)胞0.5、3、6、12、24h,其EPCRmRNA的表達(dá)分別為(95.68-4-0.76)%、(92.58~0.58]%、(95.62~0.56)%、(82.96~0.89)%(P<0.05)和(64.78~0.86)%(P<0.01)(與空白對(duì)照組比)。 2.不同濃度TNF-Q孵育ECV304細(xì)胞12h,在TNF.α濃度分別
8、達(dá)2ng/ml、10ng/ml、25ng/ml時(shí)EPCRmRNA的表達(dá)分別是對(duì)照組(100%)的(48.28~0.95)%(P<0.01)、(35.54~0.87)%(P<0.01)和(25.42~0.50)%(P 9、0.61)%(P<0.05)和(35.54~0.87)%(P<0.01)(與空白對(duì)照組比)。 3.不同濃度IL一1B孵育ECV304細(xì)胞12h,在IL.1B濃度分別達(dá)5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml時(shí)EPCRmRNA的表達(dá)分別是對(duì)照組(100%)的(40.70~0.98)%(P<0.01)、(34.44~0.56)%(P<0.01)和(10.74~0.36)%(P 10、孵育ECV304細(xì)胞0.5、3、6、12h,其EPCRmRNA的表達(dá)分別為(61.68~0.59)%(P 11、的培養(yǎng)基孵育ECV304細(xì)胞至24h。同時(shí)以相同時(shí)間的不加刺激劑組為空白對(duì)照,以相同時(shí)間的含50mmol/LD一葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24h組為陽(yáng)性對(duì)照組。其中陽(yáng)性對(duì)照組EPCRmRNA的表達(dá)為(65.50~0.81)%,曲格列酮濃度分別為5pmol/L、10~mol/L、20pmol/L預(yù)處理ECV304細(xì)胞6h后EPCRmRNA的表達(dá)分別為(72.82~0.46)%、(82.60~0.57)%和(61.86土1.59)%(與空白對(duì)照 12、組比)。 結(jié)論1.EPCR在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV304)上高表達(dá)。高糖、TNF.Q和IL-1β可以下調(diào)ECV304細(xì)胞EPCRmRNA的表達(dá),因此EPCR可以作為內(nèi)皮細(xì)朐受損的標(biāo)志物; 2.目前研究發(fā)現(xiàn)EPCR在體內(nèi)主要發(fā)揮抗凝和參與炎癥反應(yīng)的作用,國(guó)外研究表明TNF-α、IL-1β可以下調(diào)ECV304細(xì)胞EPCRmRNA的表達(dá),但國(guó)內(nèi)尚無(wú)相關(guān)研究。本研究在國(guó)內(nèi)首次證實(shí)高糖、TNF.Q和IL.1β在劑量和時(shí)間依賴(lài)水平
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