抗人GITRaa27-165蛋白單克隆抗體的制備、鑒定及初步應(yīng)用.pdf

1、目的:制備抗人GITRaa27-165(human GITRaa27-165,hGITRaa27-165)蛋白單克隆抗體(mAb)、純化并鑒定其特性；用生物素標(biāo)記其中的一株抗人GITRaa27-165蛋白單克隆抗體,構(gòu)建生物素-親和素-ELISA方法,檢測hGITR蛋白,為進一步研究hGITR的生物學(xué)功能及臨床應(yīng)用奠定實驗基礎(chǔ)。
　　 方法:本課題分三部分進行:
　　 1.分泌抗人GITRaa7-165蛋白單克隆抗體的雜

2、交瘤制備
　　 將hGITRaa27-165蛋白與完全弗氏佐劑充分乳化后,免疫6～8周齡雌性BALB／c小鼠,眼眶后靜脈叢采血獲得抗hGITRaa27-165的抗血清,間接ELISA法檢測其效價,以健康BALB／c小鼠血清為陰性對照。應(yīng)用雜交瘤技術(shù),將免疫小鼠脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞Sp2／0融合,并通過間接ELISA法篩選陽性克隆雜交瘤細(xì)胞株,擴大培養(yǎng)、凍存并進行核型分析。
　　 2.鑒定抗人GITRaa27-165蛋白單

3、克隆抗體
　　 將成功分泌抗人GITRaa27-165蛋白單克隆抗體的融合細(xì)胞注射健康BALB／c小鼠腹腔內(nèi),14天左右產(chǎn)生腹水。腹水經(jīng)系列濃度梯度飽和硫酸銨初步純化、透析、Protein G親和層析柱進一步純化后獲得腹水型抗體。用間接ELISA法測定mAb的效價及類型,以Westernblot鑒定mAb的特異性。
　　 3.構(gòu)建檢測hGITR蛋白的生物素-親和素-ELISA方法
　　 將2A5-C6 mAb與活

4、化生物素BNHS耦聯(lián),制備生物素化抗體(Bio-2A5-C6 mAb),并以186-D9 mAb作為包被抗體,以Bio-2A5-C6 mAb作為檢測抗體,確定最適的抗體包被濃度和一抗稀釋倍數(shù),構(gòu)建生物素-親和素-ELISA方法,檢測原核表達(dá)蛋白hGITRaa27-165,確定檢測hGITR蛋白的最低閾值。
　　 結(jié)果:
　　 1.以hGITRaa27-165蛋白為抗原對BALB／c小鼠進行皮下多點免疫,將hGITRaa2

5、7-165蛋白作為檢測抗原進行包被,間接ELISA法檢測其抗血清效價,效價可達(dá)1:1.28×105。雜交瘤細(xì)胞融合率為56％,經(jīng)過間接ELISA法反復(fù)篩選,陽性率為18.75％,其中對2株雜交瘤細(xì)胞進行3次克隆化,分別命名為IB6-D9和2A5-C6。核型分析發(fā)現(xiàn),抗hGITRaa27-165蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目在100條左右。
　　 2.陽性雜交瘤細(xì)胞免疫小鼠后產(chǎn)生4～5 ml的腹水,經(jīng)過分離純化后,SDS—P

6、AGE電泳分析表明,抗hGITRaa27-165蛋白單克隆抗體細(xì)胞株在52kD和23kD左右處各出現(xiàn)一條蛋白條帶,與IgG的重鏈和輕鏈的大小相符。經(jīng)間接ELISA法檢測2株雜交瘤細(xì)胞誘生腹水中的抗體效價分別為1:2.56×105和1:5.12×105,抗體類型均為IgG。Western blot結(jié)果顯示mAb均能與原核表達(dá)蛋白hGITRaa27-165特異性結(jié)合。
　　 3.成功制備Bio-2A5-C6 mAb,確定了1B6-D

7、9 mAb的最佳包被濃度為10ug／ml,Bio-2A5-C6 mAb的最佳稀釋倍數(shù)為1:5000,最低檢測hGITR的閾值為15.7ng,初步建立檢測hGITR蛋白的BA-ELISA法。利用該方法檢測梯度稀釋的原核表達(dá)蛋白hGITR,結(jié)果顯示吸光度隨蛋白濃度呈現(xiàn)一定的線性變化。
　　 結(jié)論:本研究通過雜交瘤技術(shù)獲得2株能穩(wěn)定分泌抗hGITRaa27-165蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,該細(xì)胞株所分泌的單克隆抗體可與hGITRa