Semaphorin3Fc單克隆抗體的制備鑒定及初步應(yīng)用.pdf

1、目的：
　　抑癌基因發(fā)生異常是癌癥發(fā)生的機(jī)制之一。人類基因的很多區(qū)域發(fā)生改變時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞失控性生長(zhǎng)。Sema3F作為肺癌19個(gè)候選抑癌基因之一，是Ⅲ型Semaphorin（即神經(jīng)導(dǎo)向因子，最初作為Neuropilins的配體在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮排斥神經(jīng)節(jié)軸突和調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的作用）家族的一個(gè)成員。目前有研究發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比Sema3F蛋白在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)普遍存在下調(diào)的趨勢(shì)，并在血管形成以及腫瘤增殖、凋亡、粘附和轉(zhuǎn)移等中起著負(fù)向

2、調(diào)節(jié)作用。此外，諸多體內(nèi)或者體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，Sema3F的表達(dá)水平同樣影響到腫瘤的發(fā)生發(fā)展等過(guò)程。以上證據(jù)提示Sema3F可能是一種潛在的腫瘤分子標(biāo)記物。然而，由于其多種受體的參與導(dǎo)致的功能多樣性和信號(hào)通路的復(fù)雜性，導(dǎo)致Sema3F在腫瘤生物學(xué)行為方面的研究還存在著諸多爭(zhēng)議。因此，深入研究Sema3F在腫瘤生物學(xué)行為中的作用和相關(guān)信號(hào)通路，對(duì)于進(jìn)一步闡明Sema3F作用機(jī)制、尋找腫瘤新的治療靶點(diǎn)將具有重要意義。Sema3F的C末端是其

3、發(fā)揮作用的重要結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)經(jīng)過(guò)弗林蛋白酶(furin)的蛋白水解作用被激活，從而與相應(yīng)的受體相互作用。基于上述背景，本文旨在通過(guò)傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)制備一株靶向Sema3F的C末端的單克隆抗體，通過(guò)鑒定該抗體的特性并探索該抗體在實(shí)際中的應(yīng)用，從而為開(kāi)展Sema3F的臨床診斷、預(yù)測(cè)預(yù)后以及闡明其在腫瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制提供基礎(chǔ)和技術(shù)支持。
　　方法：
　　利用Sema3F的C末端融合蛋白(Sema3Fc)作為免疫原，免疫4-6周齡

4、雌性Balb/c小鼠，通過(guò)細(xì)胞融合技術(shù)構(gòu)建可以穩(wěn)定分泌靶向Sema3F的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。然后擴(kuò)大培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，注射入Balb/c小鼠腹腔中獲得含有Sema3Fc單克隆抗體（Sema3Fc mAb）的腹水。通過(guò)rProtein A親和柱純化抗體，凍干機(jī)凍干抗體;SDS-PAGE電泳分析純化后的抗體純度;間接ELISA鑒定腹水中抗體以及純化凍干后抗體的活性;硫氰酸鹽洗脫法測(cè)定腹水中抗體的相對(duì)親和指數(shù)。然后，采用Western b

5、lotting、細(xì)胞免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)以及免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)制備的單抗與肝癌細(xì)胞株和肝癌組織中Sema3F蛋白的結(jié)合情況。利用自制的Sema3FcmAb初步建立定量檢測(cè)Sema3F的競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析方法的靈敏度和最低檢測(cè)限。此外，免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)腫瘤組織芯片中Sema3F蛋白，分析其在多種腫瘤組織、配對(duì)癌旁組織以及不同分期的乳腺癌組織中的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：

6、　　成功獲得了2株穩(wěn)定分泌Sema3Fc mAb的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為G5 mAb和E8 mAb。通過(guò)腹腔注射雜交瘤細(xì)胞得到的腹水經(jīng)rProteinA親和柱純化得到了純度較高的抗體（抗體純度約為90％，濃度約為2 mg/mL）;間接ELISA結(jié)果表明兩株雜交瘤細(xì)胞株分泌的Sema3Fc mAb滴度都在1×10-5左右;硫氰酸鹽洗脫法表明E8株抗體相對(duì)親和力指數(shù)達(dá)到了2.5mol/L，具有較高的親和力。Western blotting

7、結(jié)果顯示E8 mAb與Sema3Fc融合蛋白及兩株肝癌細(xì)胞株HepG2、BEL-7402總蛋白中的Sema3F蛋白分別在10KDa、90KDa和120KDa處有一結(jié)合條帶，說(shuō)明抗體與線性的Sema3F可以很好的結(jié)合，并具有較高的特異性;流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞免疫熒光和細(xì)胞化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單抗與肝癌細(xì)胞株中立體結(jié)構(gòu)的Sema3F蛋白也可以很好地結(jié)合，并具有很高的特異性;免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明E8 mAb可以特異性地結(jié)合肝癌組織中的Sem

8、a3F蛋白。應(yīng)用自制的抗體通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法建立了定量檢測(cè)Sema3F的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的回歸方程為Y=0.0954x+7.1839，相關(guān)系數(shù)R2=0.9948。以抑制率達(dá)到50％時(shí)的競(jìng)爭(zhēng)物（標(biāo)準(zhǔn)樣品）濃度為靈敏度和以抑制率達(dá)到10％時(shí)的競(jìng)爭(zhēng)物濃度為最低檢測(cè)限，分析得到靈敏度和最低檢測(cè)限分別為448.806ng/mL和29.52ng/mL。組織芯片免疫組化結(jié)果顯示，Sema3F在多種腫瘤組織及配對(duì)癌旁組織中均有不同程度的表達(dá);在不同分

9、期乳腺癌中，Sema3F的表達(dá)情況存在著差異。
　　結(jié)論：
　　1、本實(shí)驗(yàn)成功制備篩選出了2株穩(wěn)定分泌Sema3Fc mAb的雜交瘤細(xì)胞株并制備純化了單克隆抗體。
　　2、純化后的G5和E8株單克隆抗體經(jīng)間接ELISA方法檢測(cè)，抗體效價(jià)均能達(dá)到1×10-5，經(jīng)抗體亞型鑒定，E8株細(xì)胞分泌的單抗亞型為IgM。
　　3、經(jīng)Western blotting、流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞免疫熒光、細(xì)胞化學(xué)染色以及免疫組織化學(xué)染色鑒定