鼠源性抗人腺病毒單克隆抗體的制備、鑒定及初步應(yīng)用.pdf

1、人腺病毒(humanadenovirus，HAdv)是迄今發(fā)現(xiàn)的最大最復(fù)雜的無(wú)包膜的雙鏈DNA病毒之一。自50多年前首先被HillemanandRowe[1，2]分離以來(lái)，越來(lái)越多的研究揭示人腺病毒是引起急性呼吸道、胃腸道和眼部感染的病原。腺病毒的感染主要以區(qū)域性感染或爆發(fā)流行形式發(fā)生于兒童和招募的新兵中[3]。急性腺病毒感染一般為自限性疾病，但對(duì)于免疫功能抑制個(gè)體或免疫缺陷患者[4,5]，將會(huì)引起嚴(yán)重并發(fā)癥。尤其是7型、3型、2l型，

2、在兒童及軍隊(duì)中曾引起過(guò)嚴(yán)重的致死性肺炎[6，7]。過(guò)去幾年的研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于免疫功能抑制個(gè)體或免疫缺陷患者來(lái)說(shuō)，腺病毒已日益被確認(rèn)為具有高發(fā)病率及致死率的重要病毒病原體[3]。因缺乏有效治療藥物，腺病毒利用受損傷的免疫反應(yīng)，這樣腺病毒急性或持續(xù)感染可致機(jī)體多系統(tǒng)損害，甚至危及生命。因此，獲取有中和活性的單克隆抗體(MAb)有望成為治療藥物，并在診斷和預(yù)防方面有重要意義。
　　研究目的：
　　本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谝匀讼俨《?型抗原免

3、疫BALB/c鼠，用細(xì)胞融合技術(shù)制備具有中和活性鼠源性抗人腺病毒（HAdv）單克隆抗體（MAb）。采用中期分裂相秋水仙素阻抑法對(duì)MAb細(xì)胞株染色體進(jìn)行分析，使用鼠MAb亞型鑒定試劑盒進(jìn)行抗體亞型鑒定，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、蛋白質(zhì)印跡方法（Westernblotting）和間接免疫熒光技術(shù)進(jìn)行特異性鑒定。建立HAdv-3感染動(dòng)物模型，用獲得的HAdv-3MAb進(jìn)行保護(hù)性研究，從而為今后對(duì)人腺病毒的防治做實(shí)驗(yàn)性的探索。

4、　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.雜交瘤細(xì)胞的建立：以活的人腺病毒3型（HAdv-3）滴鼻免疫BALB/c鼠，取血清效價(jià)大于1:8000的小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合，以病毒抗原包被，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)雜瘤細(xì)胞的上清進(jìn)行篩選，陽(yáng)性孔的雜交瘤細(xì)胞給予保留，經(jīng)過(guò)有限稀釋法進(jìn)行三次克隆化，得到能夠穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
　　2.雜交瘤細(xì)胞特性分析：采用中期分裂相秋水仙素阻抑法對(duì)MAb細(xì)胞株染色體

5、進(jìn)行分析。
　　3.單克隆抗體Ig類(lèi)別、腹水效價(jià)及特異性鑒定：使用鼠MAb亞型鑒定試劑盒進(jìn)行抗體亞型鑒定，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)腹水效價(jià)，蛋白質(zhì)印跡方法（Westernblotting）和間接免疫熒光技術(shù)進(jìn)行特異性鑒定。
　　4.建立HAdv-3感染動(dòng)物模型，研究了獲得的HAdv-3MAb的體外中和活性及BALB/c小鼠感染HAdv-3的保護(hù)性作用。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.細(xì)胞融合率為86％，抗

6、體陽(yáng)性孔率為51.4％。獲得1株能穩(wěn)定分泌抗HAdv單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞（1A4）。
　　2.用中期分裂相秋水仙素阻抑法分析1株雜交瘤細(xì)胞（1A4），染色體數(shù)為98條.
　　3.應(yīng)用鼠MAb亞型鑒定試劑盒鑒定1株雜交瘤細(xì)胞（1A4），抗體亞類(lèi)屬I(mǎi)gG2a/κ，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)該抗體腹水效價(jià)達(dá)10-5，蛋白質(zhì)印跡方法（Westernblotting）結(jié)果發(fā)現(xiàn)該抗體特異性地識(shí)別HAdv-3感染細(xì)胞裂解物中相對(duì)

7、分子質(zhì)量（Mr）約為116kDa六鄰體亞單位。間接免疫熒光結(jié)果顯示，1A4MAb特異性地識(shí)別HAdv-3感染的Hep-2細(xì)胞。
　　4.該MAb的體外中和效價(jià)達(dá)到1:128。對(duì)HAdv-3感染動(dòng)物有保護(hù)性作用。
　　結(jié)論：
　　1.成功制備具有中和活性的鼠源性抗HAdv的單克隆抗體。
　　2.通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、蛋白質(zhì)印跡方法（Westernblotting）和間接免疫熒光技術(shù)分析,該單克隆抗體具