新型重組豬α-干擾素的制備及其活性分析.pdf

1、干擾素是機(jī)體在一系列誘導(dǎo)因素的作用下，產(chǎn)生的一類具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子。從1957年Isaacs和Lindenmann發(fā)現(xiàn)至今，已有很多關(guān)于干擾素的研究報(bào)道，其中大多數(shù)是著重于干擾素的規(guī)?；a(chǎn)研究，以滿足在疾病治療方面的需求。IFN作為動物體內(nèi)所知作用最快的第一道防御體系，對病毒性疾病的治療起到極其重要的作用。但是IFN機(jī)體自身表達(dá)量較低，無法滿足防治疾病的要求。所以利用基因工程技術(shù)，體外大規(guī)模獲得IFN十分必要。

2、目前所知的干擾素表達(dá)系統(tǒng)有大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和植物表達(dá)系統(tǒng)。其中大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)目前研究較為深入，具有培養(yǎng)條件簡單，操作容易，培養(yǎng)周期短，成本低，產(chǎn)量高，易于規(guī)?；扔袃?yōu)點(diǎn)。不足之處是其表達(dá)的蛋白常以包涵體的形式存在。本實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建了pET32-PoIFNα/BL21(DE3)重組菌株，并可溶性的表達(dá)出了PoIFNα。純化，WB鑒定后，進(jìn)行了生物活性測定，結(jié)果表明具有較好的抗病毒活性。主要結(jié)果如下：
　

3、　根據(jù)GeneBank中報(bào)道的豬α干擾素基因序列（M28623），設(shè)計(jì)一對引物。以豬肝臟基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增出豬α干擾素成熟肽基因?？寺〉絧ET32質(zhì)粒中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET32α-PoIFNα。經(jīng)PCR鑒定，雙酶切鑒定和測序鑒定后，轉(zhuǎn)化入BL21（DE3），篩選得到含表達(dá)質(zhì)粒的基因工程菌pET32-PoIFNα/BL21(DE3)。
　　誘導(dǎo)重組菌株表達(dá)，產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳分析，在3.8×104的位置出現(xiàn)

4、了目的蛋白條帶，與預(yù)期相符。并且，通過還原上樣緩沖液和非還原上樣緩沖液兩種方法處理樣品，證明表達(dá)蛋白是以有活性的單體形式存在的。經(jīng)過溫度、IPTG、誘導(dǎo)時(shí)間的摸索，確定了可溶性表達(dá)的最佳條件為22℃、0.5mMIPTG、誘導(dǎo)10h。在最佳條件下，大規(guī)模誘導(dǎo)工程菌，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳柱親和層析純化，得到了純度較高的重組蛋白。WB鑒定，進(jìn)一步證實(shí)了表達(dá)產(chǎn)物確實(shí)為PoIFNα。純化產(chǎn)物透析除鹽后凍干，4℃冰箱保存。
　　使用干擾素預(yù)處理Mar