新型重組豬α-干擾素的結構與生物功能研究.pdf

1、干擾素是一類Ⅱ型細胞因子，具有調節(jié)機體免疫、抗病毒、抗腫瘤等多種生物功能。根據其表面受體、染色體定位、酸穩(wěn)定性等的不同，可將干擾素分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三種類型。其中α-干擾素屬于Ⅰ型干擾素，具有強大的抗病毒功能。為了進一步提高干擾素的生物活性以及擴大干擾素在臨床上的使用，我們進行了復合豬α-干擾素的設計、表達、結構和功能的研究工作。本研究的目的在于設計重組復合豬α-干擾素，研制出安全、高效、新型的抗病毒制劑和免疫增強劑用于增強豬體的抵抗力和提

2、高現(xiàn)有疫苗的保護率。我們同時還嘗試解析豬α-干擾素的結構，并通過分子模擬的方法模建干擾素與其受體的空間結構，以便確定干擾素與受體的結合位點，為以后研究干擾素的功能并設計具有更高生物活性的干擾素打下基礎。
　　 1.CoPoIFN-α的設計、基因擴增與克隆
　　 從NCBI網站上搜索得到17個亞型的豬α-干擾素氨基酸序列，用Bioedit序列分析軟件進行比對后選取等位基因上出現(xiàn)頻率最高的氨基酸進行組合，設計出本研究中的新型

3、豬α-干擾素蛋白序列，命名為CoPoIFN-α。根據酵母密碼子偏嗜性設計得到CoPoIFN-α基因序列。根據基因序列設計14條引物，用SOE-PCR方法擴增后，通過EcoRI和Xba(I)內切酶酶切后連接入畢赤酵母表達載體pPICZα，得到帶有干擾素基因的陽性克隆，并經酶切鑒定及核酸序列測定確定其正確性。
　　 2.CoPoIFN-α的表達與純化
　　 將重組質粒pPICZα-CoPoIFN-α整合進畢赤酵母X-33菌株

4、，在畢赤酵母中用甲醇在28℃條件下誘導表達CoPoIFN-α和本實驗室保存的重組野生型豬IFN-α: PoIFN-α。誘導72 h后，12000 r/min4℃離心15 min收集酵母表達上清液。首先用30％飽和度的硫酸銨沉淀去除酵母表達上清液中的部分雜蛋白，然后再用45％飽和度的硫酸銨沉淀得到含有干擾素的粗組分，再依次經過疏水層析，陰離子交換層析和凝膠過濾層析純化得到純的干擾素蛋白PoIFN-α和CoPoIFN-α。用鼠抗重組豬IFN

5、-α1單抗作為一抗，經Western blot方法鑒定，結果顯示所得蛋白即為PoIFN-α和CoPoIFN-α。用圓二色譜方法對純化的PoIFN-α和CoPoIFN-α進行二級結構分析，分析結果表明PoIFN-α和CoPoIFN-α在溶液中都主要是以α-螺旋形式存在的。
　　 3.CoPoIFN-α的體外生物活性測定
　　 我們從4個方面檢測CoPoIFN-α的體外生物學功能，同時比較了CoPoIFN-α和 PoIFN-

6、α活性之間的差別。首先研究兩種干擾素在MDBK、PK-15和MARC-145三個細胞系上抑制水皰性口炎病毒(VSV)感染的能力。我們發(fā)現(xiàn)CoPoIFN-α抑制VSV產生細胞病變的能力比PoIFN-α分別高46.4、63.6和53.5倍。其次用1 ng CoPoIFN-α或者1 ng PoIFN-α預處理PK-15細胞24 h，然后感染PRV;同時用1 ng CoPoIFN-α或者1 ng PoIFN-α預處理MARC-145細胞24 h

7、，然后感染PRRSV;用TCD50測定方法測定細胞培養(yǎng)液中的病毒滴度，熒光定量PCR方法測定細胞中的病毒基因組拷貝數(shù)。結果表明，PoIFN-α預處理組中PRV和PRRSV的滴度分別比CoPoIFN-α預處理組高25倍和10倍;PoIFN-α預處理組中PRV和PRRSV的基因組拷貝數(shù)分別比CoPoIFN-α預處理組分別高4.8倍和5倍。另外我們用MTT方法檢測并比較了兩種干擾素抑制PK-15細胞增殖的能力。用兩倍倍比稀釋的CoPoIFN-

8、α(0-8μg/mL)或者PoIFN-α(0-8μg/mL)處理PK-15細胞72 h后，用MTT方法檢測PK-15細胞的增殖情況。結果顯示，在0.125μg/mL-0.5μg/mL干擾素濃度范圍內，CoPoIFN-α的抗增殖活性顯著高于PoIFN-α;在1μg/mL-8μg/mL干擾素濃度范圍內，CoPoIFN-α的抗增殖活力亦高于PoIFN-α，并呈現(xiàn)極顯著差異。最后我們周熒光定量PCR方法比較了PoIFN-α和CoPoIFN-α在

9、PK-15細胞上對干擾素刺激基因Mx1、OAS1和PKR基因表達的影響。
　　 用1 ng CoPoIFN-α或者PoIFN-α處理PK-15細胞24h后，通過Taqman熒光定量PCR方法檢測細胞中干擾素誘導基因Mx1、OAS1和PKR的mRNA水平。結果顯示，CoPoIFN-α或者PoIFN-α預處理的PK-15細胞中Mx1和OAS1的mRNA水平都明顯提高。其中，CoPoIFN-α預處理組的OAS1的mRNA水平比PoIF

10、N-α預處理組高3.2倍，而CoPoIFN-α預處理組Mx1的mRNA水平比PoIFN-α預處理組高4.6倍。本實驗中沒有檢測到PKR mRNA的表達。
　　 4.CoPoIFN-α作為豬瘟多肽疫苗佐劑的研究
　　 為了評估CoPoIFN-α作為豬瘟病毒多肽疫苗的佐劑效果，我們將pET-32a融合表達的CSFV囊膜蛋白E2上693-716位的氨基酸純化濃縮后與206佐劑乳化成豬瘟多肽疫苗pb，聯(lián)合104U、105U和10

11、6U的CoPoIFN-α共同免疫30日齡家豬，首免后兩周加強免疫一次。首免前一周扣首免后每周采集外周血用ELISA方法檢測血清中的CSFV抗體，首免后14d進行病毒中和抗體測定，同時采集抗凝血并分離外周血淋巴細胞，用多肽抗原刺激分離的淋巴細胞后進行淋巴細胞增殖實驗，并測定淋巴細胞分泌的IL-4和IFN-γ的水平。結果顯示，pb多肽疫苗可以誘導家豬產生體液免疫反應，CoPoIFN-α可以提高pb多肽疫苗誘導產生的體液免疫水平，并呈劑量依賴

12、性;105U的CoPoIFN-α能顯著增加pb誘導家豬產生的CSFV特異性抗體水平，但104 U的CoPoIFN-α和106 U的CoPoIFN-α只能稍微增加pb誘導家豬產生的CSFV特異性抗體水平;另外，105U的CoPoIFN-α能顯著增加pb誘導家豬產生的CSFV特異性中和抗體水平;在pb和CoPoIFN-α聯(lián)合免疫組，隨著CoPoIFN-α量的增加，淋巴細胞增殖水平和IFN-γ的分泌水平也越來越高。此結果表明，CoPoIFN-

13、α可以提高豬瘟多肽疫苗誘導家豬產生的免疫反應水平。
　　 5.CoPoIFN-α的晶體生長和計算機模擬分析干擾素及其受體的三級結構
　　 為了準確從空間結構的角度對CoPoIFN-α的高活力進行詮釋以便對其進行進一步的改造，我們嘗試通過蛋白質結晶學的方法解析CoPoIFN-α的空間結構。我們將純化的CoPoIFN-α分別濃縮至10 mg/mL和20 mg/mL兩個濃度，并用商品化晶體生長試劑盒Crystal Screen

14、、Crystal Screen2、Index和MembFac對干擾素晶體生長條件進行篩選。初步篩選出兩個蛋白晶體生長條件。通過對在這些條件下生長得到的晶體進行初步X-光射線衍射分析發(fā)現(xiàn)這些晶體的分辨率并不理想。目前正在對這些結晶條件進一步優(yōu)化，以便能夠得到衍射能力良好的晶體。
　　 在對CoPoIFN-α晶體生長條件摸索的同時，我們利用discovery studio結構模擬軟件分別模擬出CoPoIFN-α與豬Ⅰ型干擾素受體和P

15、oIFN-α與豬Ⅰ型干擾素受體三元復合物的空間結構，并對干擾素與受體的相互作用進行了分析。在復合物模型中，我們沒有觀察到兩個干擾素中有差異的殘基與受體的直接相互作用。其中，PoIFN-α上的38位絲氨酸、151位絲氨酸和43位苯丙氨酸分別突變成了CoPoIFN-α中的苯丙氨酸、丙氨酸和亮氨酸，這些突變了的氨基酸殘基側鏈朝內指向干擾素結構的核心，它們改變了局部的疏水性。156位的蘇氨酸突變成了精氨酸，蛋白質表面靜電勢分析結果顯示此突變在干