新型重組α-型干擾素的克隆、表達及活性的研究.pdf

1、 本研究課題利用生物工程技術合成了新型重組α型IFN-α(122Arg)，并對其生物活性進行了檢測。 新型重組α型IFN基因的克?。焊鶕?jù)全長DNA序列，設計大致相等的8個片段，正、反向鏈各4個。其中F1-F4為正向鏈；R1-R4為反向鏈，與設計序列相應片段互補。利用美國ABI公司生產(chǎn)的自動DNA合成儀進行合成。將PCR擴增產(chǎn)物與pUC18進行雙酶切后構建克隆載體，并轉化至大腸桿菌，經(jīng)藍白斑篩選，提取質(zhì)粒，測定插入的DNA序列表

2、明，與設計目標一致。 新型重組α型IFN基因在大腸桿菌中的表達：構建表達載體質(zhì)粒，將含全合成的人新型重組α干擾素基因片段的pUC18重組質(zhì)粒用EcoRI和BamHI雙酶切，與pBV220連接后，轉化至大腸桿菌，42℃熱誘導表達目的蛋白。結果顯示，表達蛋白主要以包涵體的形式存在。通過超聲破菌，抽提復性后以SephacrylS-200HR分離獲得目標蛋白。 新型重組α型IFN的生物活性檢測：為研究其抗乙型肝炎病毒的作用，本試驗在

3、轉染有乙型肝炎病毒基因的人肝癌細胞系2.2.15細胞中，研究了其對2.2.15細胞的毒性、HBsAg和HBeAg的分泌以及細胞培養(yǎng)液中HBV-DNA水平的影響。陽性對照藥為美國安進公司生產(chǎn)的干復津。 結果表明：新型重組α型IFN的半數(shù)中毒濃度(TC50)＞10μg/ml。最大無毒濃度(＞10μg/ml)與2.2.15細胞培養(yǎng)8天，對HBeAg和HBsAg的分泌具有一定的抑制作用。以斑點雜交法檢測表明對細胞培養(yǎng)液的HBV-DNA水平