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文檔簡介
1、 本研究課題利用生物工程技術合成了新型重組α型IFN-α(122Arg),并對其生物活性進行了檢測。 新型重組α型IFN基因的克?。焊鶕?jù)全長DNA序列,設計大致相等的8個片段,正、反向鏈各4個。其中F1-F4為正向鏈;R1-R4為反向鏈,與設計序列相應片段互補。利用美國ABI公司生產(chǎn)的自動DNA合成儀進行合成。將PCR擴增產(chǎn)物與pUC18進行雙酶切后構建克隆載體,并轉化至大腸桿菌,經(jīng)藍白斑篩選,提取質(zhì)粒,測定插入的DNA序列表
2、明,與設計目標一致。 新型重組α型IFN基因在大腸桿菌中的表達:構建表達載體質(zhì)粒,將含全合成的人新型重組α干擾素基因片段的pUC18重組質(zhì)粒用EcoRI和BamHI雙酶切,與pBV220連接后,轉化至大腸桿菌,42℃熱誘導表達目的蛋白。結果顯示,表達蛋白主要以包涵體的形式存在。通過超聲破菌,抽提復性后以SephacrylS-200HR分離獲得目標蛋白。 新型重組α型IFN的生物活性檢測:為研究其抗乙型肝炎病毒的作用,本試驗在
3、轉染有乙型肝炎病毒基因的人肝癌細胞系2.2.15細胞中,研究了其對2.2.15細胞的毒性、HBsAg和HBeAg的分泌以及細胞培養(yǎng)液中HBV-DNA水平的影響。陽性對照藥為美國安進公司生產(chǎn)的干復津。 結果表明:新型重組α型IFN的半數(shù)中毒濃度(TC50)>10μg/ml。最大無毒濃度(>10μg/ml)與2.2.15細胞培養(yǎng)8天,對HBeAg和HBsAg的分泌具有一定的抑制作用。以斑點雜交法檢測表明對細胞培養(yǎng)液的HBV-DNA水平
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