豬干擾素-γ的表達、純化及生物學活性研究.pdf

1、干擾素-γ(Interferon-gamma，IFN-γ)是一種具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調節(jié)作用的細胞因子，主要由活化的T細胞和NK細胞產(chǎn)生。IFN-γ對機體免疫系統(tǒng)具有強大的調節(jié)作用，是機體發(fā)揮免疫功能、清除體內病原體不可缺少的成分，因此，IFN-γ在疾病的診斷、治療和疫苗免疫效果檢測等方面起著重大作用，是現(xiàn)代分子生物學、免疫學和臨床醫(yī)學研究的熱點之一。本研究依照豬IFN-γ(plFN-γ)基因序列，去除信號肽后設計引物，PCR擴增該

2、基因并克隆至原核表達載體pET-30a，構建pET-30a-plFN-γ重組表達載體，經(jīng)PCR、雙酶切、測序鑒定正確后，轉化入寄主菌BL21(DE3)，用IPTG進行重組plFN-γ誘導表達，并對該表達系統(tǒng)的表達條件進行優(yōu)化，結果表明：重組plFN-γ得到正確的誘導表達，表達的最佳條件為在LB培養(yǎng)基中28℃誘導8h，誘導劑濃度為0.1mmol/L。此外還發(fā)現(xiàn)，無論在何種條件下進行誘導表達，包涵體形式的重組蛋白較可溶性形式的量多，降低誘導

3、表達溫度可使可溶性形式的重組蛋白量增加?？扇苄缘谋磉_產(chǎn)物用鎳親和層析柱純化，再用Sephadex-G100做進一步純化；而包涵體產(chǎn)物經(jīng)DOC洗滌、SKL變性溶解、透析復性進行純化。純化后的表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE、Western blot分析證實得到了高純度的重組plFN-γ。對純化的重組plFN-γ進行了一系列生物活性的研究：(1)用細胞病變抑制法對純化的重組豬IFN-γ進行抗病毒活性測定，結果表明純化的重組豬IFN-γ蛋白具有較高

4、的干擾病毒復制活性，在PK15細胞系上其對偽狂犬病毒(PRV)的抑制活性為2.0x103U.mg-1，對標準O型口蹄疫病毒抑制活性為2.56x105 U.mg-1；(2)用純化的重組豬IFN-γ對培養(yǎng)的傳代細胞PKl5進行誘導，結果顯示plFN-γ在高濃度時可誘導PK15細胞發(fā)生凋亡；(3)在體外以不同劑量的重組豬干擾素吖刺激PK15細胞和豬腹腔巨噬細胞，再用弓形蟲進行攻擊感染，結果隨著豬干擾素γ的劑量的增大，巨噬細胞抗蟲作用增強，而不