豬α干擾素基因在畢赤酵母中的表達(dá)與活性檢測.pdf

1、豬的病毒性疾病種類多、危害大，因此研發(fā)具有廣譜抗病毒作用的豬干擾素制劑具有重大意義。為了更好地利用基因工程技術(shù)來開發(fā)重組豬干擾素制劑，防治豬病毒性傳染病和進(jìn)一步開展豬干擾素分子生物學(xué)研究，本文進(jìn)行了豬α干擾素基因的克隆、表達(dá)及其重組蛋白抗偽狂犬病毒的研究。 根據(jù)GenBank己登錄的豬α干擾素基因序列，設(shè)計(jì)了含EcoRI和KpnI酶切位點(diǎn)的一對引物，采取聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法，以豬肝DNA為模板進(jìn)行了PoIFN-α的擴(kuò)增。P

2、CR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，克隆到pMD18-Simple T載體上，經(jīng)序列測定證實(shí)克隆到豬α干擾素。將克隆質(zhì)粒pMD-IFNα和pPICZαC質(zhì)粒分別用EcoRI和KpnI雙酶切，然后連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pPICzαc-IFNα。經(jīng)酶切和測序鑒定，PoIFN-α成熟蛋白基因片段插入到表達(dá)載體pPICZαC啟動(dòng)子下，并形成正確的開放閱讀框(ORF)。用Pme I單酶切pPICZαC-IFNα，電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)的畢赤酵母工程菌X3

3、3，最后涂布YPDS+ZeocinTM選擇性培養(yǎng)基，置30℃溫箱培養(yǎng)3～5天，結(jié)果獲得多個(gè)單菌落。通過提高抗生素濃度，篩選出高抗性的轉(zhuǎn)化子。先用BMGY培養(yǎng)基激活培養(yǎng)，離心后用BMMY培養(yǎng)基重懸菌體。每24小時(shí)添加一次甲醇，保持其終濃度為1.0％，誘導(dǎo)表達(dá)96小時(shí)后，收集菌液。取少量上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析和Western-Blot鑒定。然后用細(xì)胞病變抑制法進(jìn)行rPoIFN-α在BHK-21細(xì)胞上抗偽狂犬病毒粵A強(qiáng)毒株的實(shí)驗(yàn)。

4、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本研究克隆了豬α干擾素的成熟肽基因序列，全長約501bp核苷酸，編碼166個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼子組成的成熟多肽；與GenBank中的PolFN-α基因比較，核苷酸同源性為97％～99.2％，氨基酸同源性為93.4％～97.0％。SDS-PAGE和Western-Blot分析，可見一條分子量約19.4KDa清晰蛋白條帶，與理論值相符?？共《緦?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，rPoIFN-α對偽狂犬病毒在BHK-21細(xì)胞中早期增殖可呈