艱難梭菌毒素受體結(jié)合區(qū)的免疫效應(yīng)研究.pdf

1、艱難梭菌(Clostridium difficile,C.difficile)是25％以上抗生素相關(guān)性腹瀉(Antibiotic-associated diarrhea,AAD)的病因。自1978年首次發(fā)現(xiàn)該菌與偽膜性腸炎(pseudomembranous colitis,PMC)有關(guān)以后引起重視。2003年起核糖體027型(簡(jiǎn)稱(chēng)RT027)新菌株在多個(gè)國(guó)家暴發(fā)流行,造成大量死亡案例。中國(guó)也報(bào)道了散發(fā)病例。RT027因發(fā)生變異,傳染性和

2、耐藥性增強(qiáng),造成的死亡率、發(fā)病率也高于以往。很多國(guó)家包括中國(guó)將艱難梭菌作為法定傳染病必報(bào)的監(jiān)測(cè)病原。疫苗被認(rèn)為是控制CDI(C.difficile infection)最根本有效的措施。
　　艱難梭菌最主要的毒力因子是毒素A和毒素B,抑制毒素的作用就能夠有效防止感染造成的嚴(yán)重?fù)p傷,起到免疫防御的效果。毒素A和毒素B的C-端都由多個(gè)重復(fù)序列構(gòu)成,是毒素識(shí)別和結(jié)合細(xì)胞受體的功能區(qū),稱(chēng)為受體結(jié)合區(qū)(receptor-binding do

3、main,RBD),重復(fù)序列的多少直接影響毒素與細(xì)胞表面受體的結(jié)合力強(qiáng)弱。
　　艱難梭菌共有24個(gè)毒素型(toxinotype),150個(gè)核糖型,毒素的變異廣泛存在。為最大程度覆蓋保護(hù)性抗原表位,提供最大限度保護(hù),本文針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)毒型菌株(toxinotype0)ATCC43255毒素A和B的全長(zhǎng)RBD設(shè)計(jì)了候選抗原,進(jìn)行了重組制備(命名為T(mén)cdA和TcdB),考察單一或組合免疫后在小鼠中的免疫原性以及對(duì)標(biāo)準(zhǔn)株和RT027代表株AT

4、CC BAA1870毒素的保護(hù)效應(yīng)。
　　第一部分艱難梭菌天然毒素的提取、純化與鑒定
　　為驗(yàn)證ATCC43255和ATCC BAA1870的毒素差異,對(duì)兩株菌毒素A和毒素B的編碼基因進(jìn)行測(cè)序分析,表明ATCC BAA1870菌的毒素A和毒素B基因與Genbank公布的兩株027型菌(R20291,CD196)同源性均為100%。ATCC BAA1870與ATCC43255的毒素A氨基酸同源性98.15%,與毒素B氨基酸同源

5、性92.18%,兩種毒素最保守的是酶活區(qū),受體結(jié)合區(qū)變異最大。
　　為獲得ATCC43255和ATCC BAA1870的天然毒素A和毒素B,首先用硫酸銨鹽析法將培養(yǎng)菌液中的毒素沉淀和濃縮,獲得ATCC43255粗毒素80mg/L,ATCC BAA1870粗毒素86.5mg/L。用抗毒素A和抗毒素B鼠單抗經(jīng)Western blot鑒定能被特異抗毒素抗體識(shí)別,毒素相對(duì)分子量與文獻(xiàn)報(bào)道一致。以ATCC43255和ATCC BAA1870

6、粗毒素腹腔注射BALB/C小鼠的MLD分別為360ng和540ng,對(duì)Vero細(xì)胞的CD50分別為70pg,90pg,與文獻(xiàn)報(bào)道接近。為獲得純化和精制的毒素A和毒素B,將鑒定正確的粗毒素進(jìn)行DEAE Sepharose離子交換層析,最終分離得到電泳單一條帶的毒素A和毒素B,經(jīng)Western blot和VIDAS-mini系統(tǒng)鑒定證實(shí)能被抗毒素抗體識(shí)別和結(jié)合。本文建立的艱難梭菌毒素純化工藝相比文獻(xiàn)中報(bào)道的凝膠過(guò)濾后多步離子交換等方法,過(guò)程

7、簡(jiǎn)化、純化效率較高。
　　第二部分毒素受體結(jié)合區(qū)的制備及其在小鼠模型上的免疫效應(yīng)研究
　　艱難梭菌毒素的RBD與受體的結(jié)合是毒素發(fā)揮毒性的前提條件,抑制RBD的結(jié)合就能保護(hù)宿主免受毒素?fù)p傷。第二部分研究首先針對(duì)毒素A和毒素B的全長(zhǎng)RBD作為候選抗原進(jìn)行重組制備,純化獲得純度90%以上TcdA和TcdB。Western blot結(jié)果表明蛋白分子量大小正確,具有抗原性。
　　以TcdA和/或TcdB為免疫原,以氫氧化鋁為免

8、疫佐劑,肌肉途徑免疫BALB/C小鼠,基礎(chǔ)免疫7d后即產(chǎn)生1:102以上效價(jià)水平的抗TcdA和/或TcdB IgG特異抗體,一次加強(qiáng)免疫7d后血清效價(jià)最高至1:105。加強(qiáng)免疫后兩個(gè)月達(dá)到高峰,三個(gè)月后仍具有1:103以上水平,說(shuō)明TcdA和TcdB均具有良好的免疫原性。以1μg和10μg兩種免疫劑量免疫C57BL/6小鼠,研究不同免疫劑量對(duì)小鼠抗體產(chǎn)生數(shù)量的影響,發(fā)現(xiàn)除TcdA10μg+TcdB10μg與TcdA1μg+TcdB1μg

9、刺激小鼠產(chǎn)生的anti-TcdB抗體有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異外,其他高低劑量抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。C57BL/6小鼠免疫血清中和抗體效價(jià)ED50,1μg免疫組,TcdA、TcdB、TcdA+TcdB中和ATCC43255毒素的效價(jià)為:1:4960,1:1196,1:7510,中和ATCC BAA1870毒素的效價(jià)為:1:529,1:1223,1:2310;10μg免疫組,TcdA、TcdB、TcdA+TcdB中和ATCC432

10、55毒素的效價(jià)為:1:5987,1:1190,1:10643,中和ATCC BAA1870毒素的效價(jià)為:1:1563,1:933,1:6410。
　　在評(píng)價(jià)TcdA和TcdB的免疫效應(yīng)時(shí),仍設(shè)計(jì)TcdA、TcdB、TcdA+TcdB三組免疫原,分兩批受試動(dòng)物(BALB/C、C57 BL/6),基礎(chǔ)免疫和一次加強(qiáng)免疫后,利用獲得的ATCC43255和ATCC BAA1870天然毒素攻毒。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:(1) BALB/C小鼠模型中,

11、1MLD劑量攻毒時(shí),對(duì)ATCC43255毒素各免疫組保護(hù)率100%,對(duì)ATCC BAA1870毒素只有TcdA+TcdB組能提供保護(hù)率100%,其他組不能提供保護(hù);5MLD劑量攻毒時(shí),對(duì)ATCC43255毒素,除TcdB組不能提供保護(hù),其余組保護(hù)率均100%,對(duì)ATCC BAA1870毒素,各免疫組均不能提供保護(hù);20MLD劑量攻毒時(shí),對(duì)ATCC43255毒素,TcdA組和TcdA+TcdB組的保護(hù)率分別為60%和80%。(2)C57B

12、L/6模型中,考察免疫劑量(1μg和10μg)與保護(hù)效應(yīng)的關(guān)系。1μg免疫劑量,1MLD攻毒時(shí),TcdA,TcdB,TcdA+TcdB對(duì)ATCC43255毒素保護(hù)率分別均為100%;對(duì) ATCC BAA1870保護(hù)率分別為:0,100%,100%;3MLD攻毒時(shí),對(duì)ATCC43255保護(hù)率分別為:100%,40%,100%;對(duì) ATCC BAA1870保護(hù)率均為0;對(duì)5MLD ATCC43255毒素保護(hù)率分別為:87.5%,0,75%;

13、對(duì)2MLD ATCC BAA1870毒素保護(hù)率分別為:0,50%,80%。10μg免疫劑量,1MLD攻毒時(shí),TcdA,TcdB,TcdA+TcdB對(duì)ATCC43255毒素保護(hù)率分別均為100%,對(duì) ATCC BAA1870保護(hù)率分別為:100%,20%,100%;3MLD攻毒時(shí),對(duì)ATCC43255保護(hù)率分別為:100%,20%,100%;對(duì) ATCC BAA1870保護(hù)率均為0,0,60%;對(duì)5MLD ATCC43255毒素保護(hù)率分別

14、為:75%,0,87.5%;對(duì)2MLD ATCC BAA1870毒素保護(hù)率分別為:0,0,100%。以相同免疫劑量組比較在兩種動(dòng)物模型中的保護(hù)率,C57BL/6的保護(hù)效果弱于BALB/C,原因不明確。
　　綜上結(jié)果可知,重組制備的TcdA和TcdB均具有良好的免疫原性,可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高滴度抗體IgG,可有效中和毒素A和/或B,兩次免疫可為受試動(dòng)物提供免疫保護(hù)作用,TcdA和TcdB同時(shí)免疫動(dòng)物保護(hù)效果最好,對(duì)RT027代表株ATC