臨床艱難梭菌分離株快速鑒定和毒素檢測的方法學(xué)研究.pdf

1、研究背景:
　　 艱難梭菌是一種革蘭陽性、產(chǎn)毒素或非產(chǎn)毒素的厭氧芽胞桿菌。目前己被公認(rèn)為引起抗菌藥物相關(guān)性腹瀉(antibioticassociateddiarrhea，AAD)和假膜性腸炎(Pseudo-mernbranecolitis，PMC)的重要致病菌。特別是艱難梭菌感染（clostridiumdifficileinfection，CDI）所致醫(yī)院內(nèi)感染性腹瀉引起國內(nèi)外廣泛關(guān)注與重視，其發(fā)病率和所致老年住院患者死亡率呈逐

2、年上升趨勢。CDI具有無癥狀攜帶狀態(tài)、單純性抗生素相關(guān)性腹瀉、腸炎（無假膜形成）、PMC以及重癥性腸炎等多種臨床表現(xiàn)，且其致病菌具有產(chǎn)毒株和非產(chǎn)毒株之區(qū)分。實(shí)驗室開展以快速、準(zhǔn)確診斷CDI為目的的診斷技術(shù)研究尤為重要。
　　 研究目的:
　　 本研究旨在建立適合臨床微生物實(shí)驗室的艱難梭菌標(biāo)準(zhǔn)表型培養(yǎng)法，探索艱難梭菌菌種鑒定和毒素快速檢測的分子生物學(xué)技術(shù)，為快速、準(zhǔn)確診斷艱難梭菌感染提供必要的實(shí)驗室手段和依據(jù)。
　　

3、 材料與方法:
　　 本研究對象為68株菌株，其中21株為標(biāo)準(zhǔn)菌株(含1株為艱難梭菌ATCC9689)，為腸道定植菌或致病菌；47株臨床分離艱難梭菌菌株分離自2010年6月至11月收集的中日友好醫(yī)院552例臨床腹瀉糞便標(biāo)本。
　　 采用標(biāo)準(zhǔn)表型培養(yǎng)法分離腹瀉糞便中的艱難梭菌，該方法包括：含10％脫纖維羊血環(huán)絲氨酸-頭孢甲氧霉素-果糖培養(yǎng)基(cycloserine-cefoxitin-fructoseagar，CCFA)

4、上特殊菌落形態(tài)和氣味、254nm紫外光下具有黃綠色熒光、革蘭染色、谷氨酸脫氫酶(glutamatedehydrogenase，GDH)檢測、L-脯氨酸氨基肽酶(L-prolineaminopeptidase，PRO)試驗。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)分析艱難梭菌分離株的毒素特征。用于多重PCR中的3對引物分別為艱難梭菌的種特異性的磷酸丙糖異構(gòu)酶(triosephosp

5、hateisomerase，tpi)基因、毒素A基因部分序列、毒素B基因部分序列。艱難梭菌ATCC9689等21株標(biāo)準(zhǔn)菌株和47株臨床分離艱難梭菌分別被應(yīng)用于多重PCR最低檢出限、特異性評估試驗和驗證試驗。采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 結(jié)果:
　　 1．建立了可準(zhǔn)確鑒定臨床艱難梭菌分離株的標(biāo)準(zhǔn)表型培養(yǎng)法。
　　 2．艱難梭菌菌種使用含20％甘油腦心浸液（brain-heartinf

6、usion，BHI）培養(yǎng)基，-80℃可保存2年。
　　 3.552例腹瀉患者糞便標(biāo)本采用標(biāo)準(zhǔn)表型培養(yǎng)法共分離到47株艱難梭菌，對47株艱難梭菌臨床分離株產(chǎn)毒培養(yǎng)后獲得的上清液進(jìn)行艱難梭菌毒素A/BELISA檢測，20株為陽性，27株為陰性。
　　 4．建立了一種以檢測艱難梭菌tpi、tcdB和tcdA為目的的多重PCR方法，對艱難梭菌ATCC9689核酸擴(kuò)增后，電泳所得特異性條帶均符合預(yù)期目的片段長度：tpi(227bp

7、)、tcdB(144bp)、tcdA(112bp)。擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果與靶序列
　　 完全相符。
　　 5．對艱難梭菌ATCC9689不同濃度核酸分析，tpi、tcdB、tcdA產(chǎn)物均陽性的最低檢測限為5×10-4ng/μl，相當(dāng)于2×102CFU/反應(yīng)體系。對21株標(biāo)準(zhǔn)菌株核酸進(jìn)行特異性分析，tpi、tcdA、tcdB產(chǎn)物均陽性者為艱難梭菌ATCC9689，其他菌株均為陰性，表明該多重PCR特異性為100％。
　

8、　 6．對47株臨床分離艱難梭菌分析，多重PCR方法與標(biāo)準(zhǔn)表型培養(yǎng)法的菌種鑒定結(jié)果完全一致；37株為tcdA(+)/B(+)，10株為tcdA(-)/B(-)，檢測未檢出tcdA(-)/B(+)。
　　 7．多重PCR與ELISA方法對47株艱難梭菌毒素檢測結(jié)果表明，兩種方法檢測結(jié)果的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，多重PCR方法檢測毒素陽性率較高。
　　 結(jié)論:
　　 本研究成功建立了一種適合臨床微生物實(shí)驗室的標(biāo)準(zhǔn)表型培養(yǎng)