鼠婦對(duì)OPN誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的影響及其分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:血管平滑肌細(xì)胞(Vascularsmoothmusclecells，VSMC)的表型轉(zhuǎn)化、黏附、向內(nèi)膜下的遷移、增殖、分泌細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellularmatrix，ECM）是高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化和血管成形術(shù)后再狹窄（Percutaneoustransluminalcoronaryangioplasty，PTCA）等血管重塑性疾病的細(xì)胞病理學(xué)基礎(chǔ)。其中，VSMC黏附、向內(nèi)膜下的遷移及增殖，參與血管的炎性增生，導(dǎo)致血管重塑，

2、這一過程依賴于細(xì)胞與ECM之間相互作用的細(xì)微動(dòng)態(tài)平衡。研究表明，多種生長(zhǎng)因子和ECM成分如:骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)、纖連蛋白(FN)等均參與VSMC黏附、增殖與遷移的調(diào)節(jié)過程。其中ECM與整合素(integrin)相互作用所產(chǎn)生的效應(yīng)主要是通過其β亞單位胞內(nèi)區(qū)募集的蛋白激酶來調(diào)節(jié)肌球蛋白磷酸化狀態(tài)，細(xì)胞骨架重組和細(xì)胞遷移過程。
　　 整合素是由α和β亞單位組成的異源二聚體跨膜受體，VSMC主要表達(dá)整合素αvβ

3、3，它的主要配體包括OPN、FN和玻連蛋白（VN）等。由于整合素本身不具有激酶活性，它需要通過β亞單位的胞內(nèi)區(qū)與paxillin、talin、黏著斑激酶(Focaladhesionkinase，F(xiàn)AK)和整合素連接激酶(Integrin-linkedkinase，ILK)等相互作用，使其募集到胞膜內(nèi)側(cè)，共同形成黏著斑(focaladhesion)復(fù)合物，并啟動(dòng)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而導(dǎo)致細(xì)胞骨架重組，引起VSMC的黏附和遷移，參與血管的炎

4、性增生和血管重塑過程。我們?cè)谇捌诘膶?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)OPN可以誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞的黏附和遷移過程，并且FAK和ILK在這一過程中發(fā)揮重要作用。
　　 鼠婦（ArmadillidiumVulgare）又名鼠負(fù)、負(fù)蟠、鼠姑、鼠黏、地虱等，是甲殼綱等足目潮蟲科鼠婦屬動(dòng)物的俗稱?！侗静菥V目》記載鼠婦具有破血、平喘、通經(jīng)、利尿、解毒、止痛等功效?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，鼠婦有抗小鼠心律失常、鎮(zhèn)痛、抗炎的作用，目前臨床應(yīng)用鼠婦可以治療痔瘡、尋常疣、中重度癌痛

5、、口腔炎、扁桃體炎、慢性氣管炎、手術(shù)后疼痛、肝癌等等。
　　 在多種血管重塑性疾病中，血管炎性增生明顯，導(dǎo)致管腔狹窄，是造成缺血性心臟病的重要原因，而鼠婦具有抗炎的重要功效。有研究表明是鼠婦通過抑制環(huán)氧化物酶(Epoxidehydrolase，COX)起到抗炎作用，進(jìn)而參與血管重塑性疾病的發(fā)生和發(fā)展過程。但其是否影響血管炎性增生過程中血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移過程尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究觀察鼠婦對(duì)于OPN誘導(dǎo)的VSMC的遷移、增殖

6、、凋亡的影響，以及其相關(guān)的信號(hào)分子蛋白(FAK和ILK)表達(dá)活性的改變，來探討鼠婦在影響VSMC增殖和遷移方面的作用，并研究其相關(guān)的分子機(jī)制，為預(yù)防和治療以VSMC增殖和遷移為細(xì)胞病理學(xué)基礎(chǔ)的血管炎性增生性疾病（如動(dòng)脈粥樣硬化、PTCA后再狹窄等）提供合理的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，奠定理論基礎(chǔ)，并提供新的治療靶點(diǎn)。
　　 方法:
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)
　　 按常規(guī)方法培養(yǎng)SD大鼠胸腹主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞，選取3-5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)

7、。
　　 2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)VSMC凋亡
　　 原代細(xì)胞培養(yǎng)至3-5代后，細(xì)胞分為7組，每組3-5瓶，分為對(duì)照組;不同濃度鼠婦水提取物組（W組），分別為0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml;不同濃度鼠婦乙酸乙酯提取物組（E組），分別為0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml;繼續(xù)37℃孵育24小時(shí)，收集各組細(xì)胞，PBS清洗2次，常溫離心機(jī)離心2000轉(zhuǎn)/分鐘，8分鐘，棄上清，加入70％乙醇固定，振蕩器混

8、勻后，4℃冰箱保存，1周內(nèi)送省四院實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)晚期細(xì)胞凋亡。
　　 3.MTT法分別測(cè)定鼠婦水提取物和乙酸乙酯提取物對(duì)基礎(chǔ)培養(yǎng)和OPN誘導(dǎo)的VSMC增殖的影響
　　 3.1.收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至5X104個(gè)/ml，接種于96孔板，200ul/孔，5％CO2，37℃孵育24小時(shí)。
　　 3.2.24小時(shí)后棄去培養(yǎng)液，加入無血清DMEM培養(yǎng)液，每孔200ul，分組如下，測(cè)定鼠婦對(duì)基礎(chǔ)培養(yǎng)V

9、SMC增殖影響時(shí)分為空白組、對(duì)照組、不同濃度的鼠婦W組（即0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml組）和不同濃度鼠婦E組（即0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml組）;測(cè)定鼠婦對(duì)OPN誘導(dǎo)的VSMC增殖影響時(shí)分為空白組、對(duì)照組、OPN組，不同濃度的鼠婦水提取物+OPN組（濃度分為0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml組）和不同濃度鼠婦乙酸乙酯提取物+OPN組（濃度分為0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/m

10、l組），每組重復(fù)3-5孔，37℃孵育24小時(shí)。
　　 3.3.每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5％MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。
　　 3.4.棄去上清，終止培養(yǎng)。
　　 3.5.每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，490nm測(cè)量各孔的吸光度值。
　　 3.6.分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，觀察鼠婦對(duì)VSMC增殖的影響，并確定鼠婦的最佳有效濃度。

11、>　　 4.傷口愈合實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞遷移
　　 VSMC培養(yǎng)至3-5代后，接種于6孔板中的消毒玻片上，分4組，分別為對(duì)照組，OPN組(20ug/ml)，鼠婦W組(0.5mg/ml)和鼠婦E組(1mg/ml)，細(xì)胞生長(zhǎng)至100％匯合后，取出玻片，用無菌吸頭在玻片上劃痕。PBS洗凈被刮下的細(xì)胞后，將玻片置于各組培養(yǎng)液中，繼續(xù)孵育24h后取出，于低倍鏡下觀察細(xì)胞傷口愈合情況，任意取3個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞的數(shù)量，以此表示細(xì)胞的遷移活性。<

12、br>　　 5.Westernbolt檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、FAK、ILK蛋白表達(dá)水平收集各組VSMC→PBS洗滌→使用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白→蛋白定量→SDS-PAGE電泳→PVDF膜轉(zhuǎn)移→5％脫脂奶粉封閉，37℃1-2h→與一抗共孵育，4℃過夜→TTBS洗三次，10分鐘/次→與兔抗鼠IgG共孵育，37℃1-2h→TTBS洗三次，10分鐘/次，TBS洗一次，5分鐘/次→化學(xué)發(fā)光法顯影，用凝膠圖像分析系統(tǒng)記錄并測(cè)定各蛋

13、白條帶的積分光密度，以與β-actin的比值計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。
　　 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用(X)±s表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行組間及組內(nèi)方差分析。Excel軟件作圖。各組檢驗(yàn)均以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.細(xì)胞凋亡檢測(cè)
　　 使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果表明，對(duì)照組及各濃度鼠婦W組、鼠婦E組之間細(xì)胞凋亡差別不大，無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明實(shí)

14、驗(yàn)濃度范圍內(nèi)鼠婦水提取物和乙酸乙酯提取物不影響VSMC的凋亡過程。
　　 2.MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖
　　 2.1.鼠婦水提取物對(duì)基礎(chǔ)培養(yǎng)VSMC增殖的影響
　　 MTT法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各濃度的鼠婦W組不影響基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下的VSMC增殖活性，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間吸光度值無明顯差異，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)也說明此濃度范圍內(nèi)的鼠婦水提取物對(duì)VSMC無細(xì)胞毒性。
　　 2.2.鼠婦乙酸乙酯提取物對(duì)基礎(chǔ)培養(yǎng)VSMC增殖的

15、影響
　　 與2.1結(jié)果相似，各濃度鼠婦E組對(duì)于基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下的VSMC增殖也無明顯作用，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差別，同時(shí)也說明對(duì)細(xì)胞無毒性作用。
　　 2.3.鼠婦水提取物對(duì)OPN誘導(dǎo)的VSMC增殖的影響
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鼠婦水提取物對(duì)于OPN誘導(dǎo)的VSMC增殖起抑制作用，但隨著鼠婦水提取物的濃度的增加，抑制作用減弱。統(tǒng)計(jì)分析表明，鼠婦W組（0.5mg/ml和1mg/ml）吸光度值分別為OPN組的85.5％和90

16、.9％，兩者與OPN組之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05，說明低濃度鼠婦水提取物有抑制OPN誘導(dǎo)的VSMC增殖的作用。
　　 2.4.鼠婦乙酸乙酯提取物對(duì)OPN誘導(dǎo)的VSMC增殖的影響
　　 MTT法結(jié)果顯示，鼠婦乙酸乙酯提取物對(duì)于OPN誘導(dǎo)的VSMC增殖也起抑制作用，且該抑制作用隨著鼠婦濃度的增加而增強(qiáng)，呈劑量依賴性。當(dāng)鼠婦E組濃度為1mg/ml時(shí)，其吸光度值為0.22667，是OPN組的81.6％，兩者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

17、，P＜0.05。比較鼠婦W組（0.Smg/ml）與E組(1mg/ml)對(duì)細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)兩者之間差別不大，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明兩者都可以抑制OPN誘導(dǎo)的VSMC增殖，無優(yōu)劣之分。
　　 3.傷口愈合實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞遷移
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，劃痕24h后對(duì)照組VSMC向中間遷移的較少，而給予OPN刺激后，大量VSMC從傷口兩側(cè)向中間遷移，使傷口面積大大縮小;而給予0.5mg/ml的鼠婦水提取物后，細(xì)胞的遷移能力受到明顯抑制，

18、遷移的細(xì)胞數(shù)下降為OPN組的76.7％;同樣的，給予1mg/ml的鼠婦乙酸乙酯提取物也可以抑制OPN誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移，遷移的細(xì)胞數(shù)為OPN組的69.3％，其作用大于鼠婦W組。這說明鼠婦水提取物和乙酸乙酯提取物均可抑制OPN誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移，且1mg/ml的鼠婦乙酸乙酯提取物效果更明顯。
　　 4.Westernbolt檢測(cè)PCNA、FAK、ILK蛋白表達(dá)水平
　　 4.1.Westernbolt檢測(cè)PCNA蛋白表達(dá)水平

19、>　　 WB結(jié)果表明，對(duì)照組PCNA蛋白表達(dá)水平比較低，給予OPN刺激后，其蛋白含量明顯增加，為對(duì)照組的1.59倍，但給予鼠婦后PCNA的表達(dá)下降，即OPN+各濃度鼠婦W組及OPN+各濃度鼠婦E組均可降低PCNA的表達(dá)水平，兩者的劑量依賴趨勢(shì)與MTT法結(jié)果一致，其中0.5mg/ml的鼠婦W組和1mg/ml的鼠婦E組抑制作用最明顯，分別為OPN組的77.8％和74.1％。這進(jìn)一步證明鼠婦的這兩種提取物可以抑制OPN誘導(dǎo)的VSMC增殖。<

20、br>　　 4.2.Westernbolt檢測(cè)ILK蛋白表達(dá)水平
　　 給予OPN刺激后，ILK的表達(dá)水平明顯增加，這與我們前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。在OPN+鼠婦W組實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到隨著鼠婦濃度的增加，ILK的表達(dá)水平是逐漸升高的，即低濃度(0.5mg/ml)的鼠婦W組抑制OPN誘導(dǎo)的ILK表達(dá)作用更明顯，是OPN組的81.4％;但是，在OPN+鼠婦E組實(shí)驗(yàn)中，隨著鼠婦濃度的增加，ILK的表達(dá)水平?jīng)]有明顯的改變，這說明鼠婦水

21、提取物可以通過抑制ILK來影響OPN誘導(dǎo)的VSMC增殖和遷移。
　　 4.3.Westernbolt檢測(cè)FAK蛋白表達(dá)水平
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OPN可以顯著的誘導(dǎo)FAK表達(dá)，這也與我們前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。在OPN+鼠婦W組實(shí)驗(yàn)中，低濃度(0.5mg/ml)的鼠婦W組抑制OPN誘導(dǎo)的FAK表達(dá)作用更明顯，是OPN組的89.1％;而在OPN+鼠婦E組實(shí)驗(yàn)中，高濃度（1mg/ml）的E組作用更明顯，為OPN組的82.2％。這

22、說明鼠婦的水提取物既可以影響FAK途徑也可以影響ILK途徑，而鼠婦乙酸乙酯提取物主要通過調(diào)節(jié)FAK途徑來影響OPN誘導(dǎo)的VSMC增殖和遷移過程。
　　 結(jié)論:
　　 1.實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)的鼠婦水提取物和乙酸乙酯提取物不影響VSMC的凋亡過程，對(duì)VSMC無細(xì)胞毒性。
　　 2.鼠婦水提取物和乙酸乙酯提取物不影響基礎(chǔ)培養(yǎng)下的VSMC增殖。
　　 3.鼠婦水提取物和乙酸乙酯提取物均可抑制OPN誘導(dǎo)的VSMC增殖。

23、
　　 4.鼠婦水提取物和乙酸乙酯提取物均可抑制OPN誘導(dǎo)的VSMC遷移。
　　 5.鼠婦的兩種提取物均可以抑制OPN誘導(dǎo)的PCNA表達(dá)的增加。
　　 6.鼠婦水提取物可以抑制OPN誘導(dǎo)的ILK表達(dá)的增加，而乙酸乙酯提取物無該作用。
　　 7.鼠婦水提取物和乙酸乙酯提取物對(duì)于OPN誘導(dǎo)的FAK表達(dá)增加均有抑制作用。
　　 8.鼠婦乙酸乙酯提取物通過FAK途徑，而鼠婦水提取物通過FAK和ILK兩條途