MCP-1誘導血管平滑肌細胞增殖的機制.pdf

1、目的：研究單核細胞趨化蛋白1（Monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）誘導血管平滑肌細胞增殖的機制；
　　方法：1.MCP-1作用VSMCs24 h后，用NADPH氧化酶活性測定試劑盒檢測細胞內(nèi) NADPH氧化酶活性變化。2.MCP-1作用血管平滑肌細胞（VSMCs）不同時間后加入熒光探針DCFH-DA，用熒光顯微鏡測定細胞內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）

2、的含量變化。3.MCP-1作用VSMCs不同時間后Western blot檢測p-AKT、AKT蛋白表達情況。4.MCP-1處理細胞后用CCK-8試劑盒測定DPI和LY294002對VSMCs細胞活力的影響。5.構(gòu)建過表達 MCPIP1的血管平滑肌細胞模型(over expression-MCPIP1，oe-MCPIP1）：用MCPIP1表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染VSMCs；用熒光顯微鏡觀察及Western blot檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)MCPIP1蛋

3、白表達情況，確定最佳轉(zhuǎn)染時間。6.，用100 ng/mL MCP-1作用oe-MCPIP1模型細胞24h，采用熒光顯微鏡細胞計數(shù)測定細胞數(shù)量變化；流式細胞術(shù)測定細胞周期變化；CCK-8試劑盒測定細胞活力變化；EDU試劑盒檢測DNA合成率的變化。
　　結(jié)果：1.MCP-1處理VSMCs24 h后，NADPH氧化酶活性升高，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）;2.熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)ROS生成量：MCP-1作用VSMCs12

4、 h,24 h,48 h后，與對照組相比，ROS含量顯著上升（p＜0.01），并在12 h，24 h，48 h三個時間形成平臺效應；3.MCP-1作用VSMCs15,30,60 min后與對照組相比p-AKT蛋白表達升高（p＜0.05），作用15 min后p-AKT/AKT比值達到峰值（p＜0.05），30和60 min時AKT蛋白仍有持續(xù)性的磷酸化（p＜0.05）。4.MCP-1處理VSMCs24 h，并分別加入DPI、Ly29400

5、2后與MCP-1單獨作用組相比細胞活力顯著降低（p＜0.05）。5.經(jīng)DNA測序和雙酶切鑒定，證明MCPIP1表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。轉(zhuǎn)染MCPIP1表達質(zhì)粒48 h后，MCPIP1表達量達到峰值（p＜0.05）。6.用MCP-1處理oe-MCPIP細胞后，與單獨MCP-1作用組相比，細胞數(shù)量顯著升高（p＜0.05），細胞活力明顯上升（p＜0.05），S期細胞百分比增多（p＜0.05），DNA合成率顯著上升（p＜0.05）。
　　結(jié)論：