Apelin促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的作用機(jī)制.pdf

1、目的:血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)可呈現(xiàn)分化型和增殖型兩種表型，這兩種表型間的相互轉(zhuǎn)化是引起血管重塑性疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化、血管再狹窄等血管增殖性疾病的病理學(xué)基礎(chǔ)。孤兒G蛋白偶聯(lián)受體APJ和它的內(nèi)源性配體apelin（apelin/APJ系統(tǒng)）在心血管系統(tǒng)中具有降低血壓、增強(qiáng)心肌收縮的作用，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有調(diào)節(jié)垂體激素釋放、調(diào)節(jié)攝食、攝水、體液平衡等作用。近年發(fā)現(xiàn)，apelin還具有促進(jìn)新生血管生成的作用。在新生血管形成中，內(nèi)皮細(xì)胞中

2、的apelin和APJ的表達(dá)受時(shí)序調(diào)控。體外實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，apelin/APJ系統(tǒng)通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和形成索狀構(gòu)造來調(diào)節(jié)新生血管形成。此外，apelin還具有穩(wěn)定內(nèi)皮細(xì)胞之間相互連接的作用。遺傳工程小鼠模型也表明，在生理和病理血管形成過程中，apelin/APJ調(diào)節(jié)新生血管的成熟和穩(wěn)定。Apelin蛋白前體含有77個(gè)氨基酸，多肽鏈中含有多個(gè)成對的堿性氨基酸殘基（Arg-Arg或Arg-Lys）。在體內(nèi)apelin可被內(nèi)肽酶剪切成

3、多種含有C末端片段的產(chǎn)物，包括apelin-13，apelin-17及apelin-36，apelin-36是其主要的存在形式。這些apelin亞型都是APJ的配體，與APJ結(jié)合后產(chǎn)生不同的生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)，比較短的apelin肽鏈對APJ更有親和力，因此，apelin-13比其他亞型多肽表現(xiàn)出更強(qiáng)的生物學(xué)活性。基于對apelin/APJ系統(tǒng)促進(jìn)新生血管形成是否與促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖和遷移有關(guān)目前尚不清楚，本研究觀察a

4、pelin-13對VSMC遷移和增殖的影響，并探討其作用機(jī)制。
　　 方法:用貼塊法分離、培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈VSMC，Westernblot分析檢測mmp-2、NF-κB、cyclinD1、cyclinE1等基因的表達(dá)，cck-8法檢測細(xì)胞增殖情況，傷口愈合實(shí)驗(yàn)檢測VSMC遷移能力，鬼比環(huán)肽染色觀察細(xì)胞形態(tài)和應(yīng)力纖維的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.Apelin-13促進(jìn)VSMC增殖和遷移
　　 用0、0.1

5、、0.5、1μMapelin-13分別刺激VSMC24h后，加入cck-8試劑孵育2h，在酶標(biāo)儀450nm處讀取O.D值。結(jié)果顯示，apelin-13可以誘導(dǎo)VSMC增殖，且隨著濃度升高，促增殖效果逐漸增強(qiáng)。
　　 在傷口愈合實(shí)驗(yàn)中，用0.1μMapelin-13刺激VSMC24h后，進(jìn)行HE染色，顯微鏡下可觀察到apelin-13刺激顯著促進(jìn)VSMC遷移。
　　 2.Apelin-13誘導(dǎo)cyclinD1、cyclin

6、E1、NF-κB和mmp-2表達(dá)
　　 Westernblot分析結(jié)果顯示，分別用0、0.1、0.5、1μMapelin-13刺激VSMC24h后，與對照組相比，apelin-13刺激使cyclinD1、cyclinE1、NF-κB、mmp-2表達(dá)明顯升高。
　　 用0.1μMapelin-13分別刺激VSMC0、6、12、24h后，cyclinD1、NF-κB、mmp-2表達(dá)隨刺激時(shí)間延長而逐漸上調(diào)。以上結(jié)果表明，ap

7、elin-13可劑量和時(shí)間依賴性的誘導(dǎo)增殖相關(guān)基因表達(dá)。
　　 3.Apelin-13抑制VSMC分化
　　 用0.1μMapelin-13刺激VSMC24h后，分別檢查VSMC分化標(biāo)志基因SM22α、α-actin的表達(dá)和細(xì)胞骨架形態(tài)變化。結(jié)果表明，給予apelin-13刺激后，SM22α和α-actin的表達(dá)下調(diào)。鬼筆環(huán)肽染色顯示，apelin-13刺激后，VSMC形態(tài)由長梭形轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟切危?xì)胞骨架不規(guī)則，肌絲顯著減

8、少。以上結(jié)果表明，apelin-13抑制VSMC分化。
　　 4.Akt/ERK信號(hào)通路介導(dǎo)apelin-13誘導(dǎo)的VSMC增殖
　　 在用Westernblot分析檢測apelin-13對VSMC中Akt和ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，用0.1μMapelin-13刺激VSMC0min～6h后，Akt磷酸化在30min時(shí)達(dá)到峰值，ERK磷酸化水平在4h時(shí)達(dá)到最高，之后逐漸降低，但到6h仍高于對照組。
　　 用

9、50μMAkt抑制劑ly294002預(yù)孵育VSMC1h，再用0.1μMapelin-13刺激VSMC30min后，收集蛋白進(jìn)行Westernblot分析。結(jié)果顯示，(l)y294002可以抑制apelin-13誘導(dǎo)的Akt和ERK磷酸化及cyclinD1表達(dá)。
　　 用20μMERK抑制劑PD98059預(yù)孵育VSMC1h，再用0.1μMapelin-13刺激VSMC4h后，收集蛋白進(jìn)行Westernblot分析。結(jié)果顯示，PD9

10、8059可以抑制apelin-13誘導(dǎo)的ERK磷酸化和cyclinD1表達(dá)。這些結(jié)果表明，Akt/ERK信號(hào)通路介導(dǎo)apelin-13誘導(dǎo)的VSMC增殖。
　　 結(jié)論:
　　 1.Apelin-13促進(jìn)VSMC增殖和遷移。
　　 2.Apelin-13促進(jìn)VSMC增殖與誘導(dǎo)增殖相關(guān)基因cyclinD1，cyclinE1，NF-κB，andmmp-2表達(dá)相關(guān)。
　　 3.Apelin-13抑制VSMC分化。