OPN反義核苷酸抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖機(jī)制的研究.pdf

1、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)介入（percutaneouscoronaryintervention，PCI）術(shù)是目前治療冠心病最有效的手段之一，但PCI術(shù)后3到6個(gè)月內(nèi)血管重建部位再狹窄（restenosis，RS）的發(fā)生在一定程度上限制了其應(yīng)用[1～3]。大量研究表明，RS的發(fā)生是一個(gè)多因子參與的復(fù)雜病理過程，其中包括血管彈性回縮、血小板黏附聚集及血栓形成、新生內(nèi)膜形成等多個(gè)環(huán)節(jié)。其中主要機(jī)制是血管損傷局部中膜平滑肌細(xì)胞（smoothmuscle

2、cell，SMC）過度增殖，向內(nèi)膜遷移及細(xì)胞外基質(zhì)形成引起的內(nèi)膜增生[4]。因此尋找有效的手段抑制SMC增殖和遷移對臨床預(yù)防RS具有重要的指導(dǎo)意義。
　　 骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是細(xì)胞外基質(zhì)中一種重要的功能性蛋白，差異顯示技術(shù)證明OPN是血管平滑肌細(xì)胞（vascularsmoothmusclecell，VSMC）表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)志基因，其表達(dá)決定了VSMC的表型[5]。多項(xiàng)研究表明，OPN在血管損傷后新生內(nèi)膜中的

3、表達(dá)明顯上調(diào)，而且它能促進(jìn)VSMC和外膜細(xì)胞的增殖、遷移，被認(rèn)為是血管損傷修復(fù)過程中重要的始動(dòng)因素[6]。盡管OPN在促進(jìn)VSMC增殖的過程中起著重要的作用，但其具體機(jī)制研究尚少。本課題擬通過初步探討OPN反義核苷酸對大鼠血管SMC增殖的影響及其機(jī)制，進(jìn)而為OPN作為防治RS的新靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 材料和方法：
　　 一、大鼠A10主動(dòng)脈VSMC的培養(yǎng)
　　 用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在

4、37℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)大鼠A10主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。用0.25％胰酶消化、傳代。傳代以后使用含10％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素，pH7.4的DMEM維持細(xì)胞生長，2～3天換液一次，選取3～8代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　 二、OPN反義核苷酸的轉(zhuǎn)染
　　 委托Takara公司合成OPN反義核苷酸，并應(yīng)用轉(zhuǎn)染試劑FuGENE6對VSMC進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。操作步驟嚴(yán)格按轉(zhuǎn)染試劑FuGENE6使

5、用說明書進(jìn)行。
　　 三、實(shí)驗(yàn)方法
　　 MTT比色法測定OPN反義核苷酸轉(zhuǎn)染對VSMC增殖的影響；FCM分析OPN反義核苷酸轉(zhuǎn)染對VSMC細(xì)胞周期分布的影響；RT-PCR檢測OPNmRNA、PCNAmRNA；
　　 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。One-wayANOVA分析不同組間參數(shù)比較，兩兩比較采用LSD方法。p<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異。
　　 實(shí)驗(yàn)

6、結(jié)果：
　　 1、MTT結(jié)果顯示：OPN反義核苷酸轉(zhuǎn)染24、48、72h后，細(xì)胞增殖抑制率分別為24％、19.6％、17％，與對照組相比，有明顯差異（P<0.05），說明OPN反義核苷酸對VSMC的增殖有明顯的抑制作用，并且隨時(shí)間延長對細(xì)胞增殖抑制率下降。
　　 2、FCM分析顯示：OPN反義核苷酸主要作用于G1/S限制點(diǎn)，能阻止VSMC由G0/G1期向S期推進(jìn)，從而將VSMC阻滯于G0/G1期，抑制VSMC的增殖。