ROCKⅠ對PDGF介導血管平滑肌細胞遷移分子機制的研究.pdf

1、目的:動脈粥樣硬化(AS)是威脅人類健康的主要疾病之一,對于AS發(fā)病機制一直是心血管疾病研究的熱點。其中血管平滑肌細胞(VSMC)由中膜層向內膜下間隙遷移并導致異常增生是動脈粥樣硬化等心血管疾病發(fā)生發(fā)展的一個重要環(huán)節(jié)。PDGF作為一種強有力的體外趨化劑,可以誘導VSMC增殖和遷移。ROCK是Rho下游靶效應分子,分ROCKⅠ和ROCKⅡ兩種亞型,參與細胞遷移、細胞增殖、細胞粘附、細胞骨架重組等多種細胞行為,而這些功能又參與許多心血管疾病

2、的發(fā)生、發(fā)展,而ROCK參與細胞遷移的分子機制尚不十分清楚。有文獻報道,MAPK家族成員參與細胞的增殖和遷移,如p38 MAPK,ERK(胞外信號調節(jié)激酶)。此外在細胞遷移過程中,基質金屬蛋白酶(MMPs)可以廣泛降解ECM,為VSMC的遷移掃清道路,促進VSMC的遷移。本實驗研究目的在于通過PDGF介導血管平滑肌細胞遷移的模型,闡述ROCKⅠ亞型調控血管平滑肌細胞研究的分子機制,為闡明動脈粥樣硬化發(fā)生機理提供理論依據(jù)。
　　

3、方法:(1)利用瞬時轉染和穩(wěn)定轉染方法過表達ROCKⅠ,通過RNA和蛋白水平檢測ROCKⅠ的表達情況;(2)利用Boyden chamber和劃痕方法,檢測ROCKⅠ過表達后,細胞的遷移情況;(3)利用Westem blot方法,在10ng/ml PDGF刺激下,檢測p-ERK和p-p38在不同時間的表達情況;(4)利用Westem blot方法,在不同濃度U0126(ERK抑制劑)和SB203580(p38抑制劑)處理下,檢測p-ER

4、K和p-p38表達情況;(5)利用Boyden chamber法,在不同濃度U0126和SB203580處理下,檢測對細胞遷移的影響;(6)利用Westem blot和明膠酶譜法,檢測U0126和SB203580對MMP2蛋白表達和活性的影響;(7)利用免疫熒光方法,在不同濃度U0126和SB203580處理下,檢測抑制劑對細胞偽足形成的影響。
　　 結果:(1)瞬時轉染ROCKⅠ過表達后,細胞遷移明顯增加;(2)PDGF(10

5、ng/ml)刺激下,p-ERK和p-p38表達水平分別出現(xiàn)峰值;(3)不同濃度U0126和SB203580處理下,p-ERK和p-p38表達隨濃度依賴性下降;(4)在不同濃度U0126和SB203580處理下,細胞遷移能力隨濃度依賴性下降;(5)U0126和SB203580均降低MMP2的蛋白表達和活性;(6)U0126和SB203580減少細胞偽足的形成。
　　 結論:(1)進一步證實ROCKⅠ與血管平滑機細胞的遷移密切相關;