雌激素通過TRAIL抑制TNF-α誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的機(jī)制研究.pdf

1、目前已有研究顯示，體內(nèi)血清中TRAIL表達(dá)水平與E2水平呈顯著負(fù)相關(guān)，并且體外實(shí)驗(yàn)顯示，給予E2處理后，可明顯降低外周血單核細(xì)胞TRAIL的表達(dá)，這表明TRAIL可能是E2的調(diào)控靶點(diǎn)。
　　綜上所述，本研究將探討E2對(duì)VSMCs中TRAIL的表達(dá)影響，并進(jìn)一步闡明E2抑制VSMCs增殖和遷移的作用機(jī)制，本文分為以下幾部分。
　　第一章 E2對(duì)VSMCs中TNF-α誘導(dǎo)的TRAIL表達(dá)影響
　　為了探討E2對(duì)VSMCs中

2、TNF-α誘導(dǎo)的TRAIL表達(dá)影響，筆者分別采用ELISA和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測TRAIL蛋白和mRNA表達(dá)水平，并用MTT法和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察E2對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的VSMCs增殖和遷移的影響。
　　1.1 TNF-α通過TRAIL促進(jìn)VSMCs增殖和遷移
　　筆者用不同濃度的TNF-α(1ng/ml、10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml)處理大鼠的VSMCs24h，分別用ELISA和實(shí)時(shí)熒光定量PC

3、R方法檢測培養(yǎng)液與細(xì)胞裂解液中TRAIL蛋白表達(dá)濃度以及VSMCs中TRAIL mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，TRAIL蛋白表達(dá)，與對(duì)照組比較，當(dāng)TNF-α濃度大于等于10 ng/ml時(shí)可明顯增加VSMCs中的TRAIL表達(dá)，增長率分別為(56.6±7.8)％、（80.9±9.2）％、(119.1±11.3)％(n=5,*p＜0.01 vs.CON;**p＜0.001 vs.CON); TRAILmRNA表達(dá)水平與對(duì)照組比較，同樣在TNF

4、-α處理濃度大于等于10 ng/ml時(shí)可明顯增加TRAIL mRNA表達(dá)，增長率分別為(110±10.9)％、（180±13.1）％、(220±13.2)％，（n=5，**p＜0.01 vs.CON）。
　　1.2 E2呈濃度依賴性抑制TNF-α誘導(dǎo)的TRAIL表達(dá)
　　為了觀察E2對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的TRAIL表達(dá)的影響，筆者用模擬生理濃度的E2（10-9M、10-8M、10-7M、10-6M）預(yù)處理大鼠VSMCs24h，再

5、用TNF-α(100ng/ml)處理24h，分別用ELISA和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測培養(yǎng)液與細(xì)胞裂解液中TRAIL的蛋白表達(dá)水平以及VSMCs中TRAIL mRNA表達(dá)水平。
　　小結(jié):TNF-α可增加VSMCs中TRAIL表達(dá)，從而促進(jìn)VSMCs增殖和遷移，此作用可被E2抑制，并由ERα所介導(dǎo)。
　　第二章 E2通過抑制NF-κB通路抑制TRAIL表達(dá)
　　為了探討E2抑制TRAIL表達(dá)上調(diào)的作用機(jī)制，筆者用不同

6、的蛋白酶抑制劑篩選出參與此效應(yīng)的信號(hào)通路，并用Western blot方法及活性檢測試劑盒觀察E2對(duì)此通路的調(diào)節(jié)作用。
　　2.1 TNF-α通過NF-κB上調(diào)TRML表達(dá)
　　筆者用不同信號(hào)通路抑制劑:NF-κB抑制劑PDTC（20μM）、p38抑制劑ML3403（50μM）、JNK抑制劑IQ1S（20μM）、MEK抑制劑PD98059（5μM）和ERK1/2抑制劑FR180204(20μM)）提前處理VSMCs24 h后

7、，再用TNF-α繼續(xù)處理24 h，分別用ELISA和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測TRAIL蛋白和mRNA表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TNF-α可明顯促進(jìn)TRAIL蛋白和mRNA表達(dá)，而只有NF-κB抑制劑PDTC處理組TRAIL蛋白和mRNA表達(dá)受到抑制，其中蛋白表達(dá)抑制率為（44.4±3.3）％，mRNA抑制率為（59.1±5.6）％(n=5，*p＜0.01 vs.CON;#p＜0.01 vs.TNF-α)。說明TNF-α促進(jìn)TRAIL蛋白和m

8、RNA表達(dá)是由NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的，而與MAPK信號(hào)通路無關(guān)。
　　2.2 E2抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB p65磷酸化和轉(zhuǎn)位
　　用10-8M濃度的E2預(yù)處理大鼠VSMCs24 h，再用TNF-α(100 ng/ml)處理15 min，用Western blot方法分別檢測細(xì)胞內(nèi)p65磷酸化水平，胞漿p65以及胞核內(nèi)p65蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，TNF-α可明顯提高p65蛋白磷酸化水平，增加率為（773.0±13.

9、9）％，同時(shí)可增加細(xì)胞核內(nèi)p65蛋白表達(dá)，增加率為（698.6±19.7）％，即促進(jìn)p65從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移;用E2預(yù)處理的實(shí)驗(yàn)組，p65磷酸化水平降低，與單純的TNF-α處理組比較，抑制率為（89.8±12.9）％，同時(shí)還可抑制p65向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，即抑制細(xì)胞核內(nèi)p65蛋白水平，抑制率為(86.2±11.8)％(n=5,*p＜0.001 vs.CON;#p＜0.001 vs.TNF-α)。
　　2.3 E2抑制TNF-α誘導(dǎo)的

10、IκBα磷酸化
　　用10-8M濃度的E2預(yù)處理大鼠VSMCs24 h，再用TNF-α(100 ng/ml)處理15 min，用Western blot方法分別檢測細(xì)胞內(nèi)磷酸化IκBα水平以及IκBα的總表達(dá)量。結(jié)果提示，TNF-α可明顯提高IκBα蛋白磷酸化水平，增加率為（776.5±17.3）％，此作用可被E2抑制，抑制率為（86.2±6.2）％(n=5，*p＜0.001 vs.CON，#p＜0.001vs.TNF-α)。而T

11、NF-α與E2對(duì)總的hκBα蛋白表達(dá)無顯著影響。
　　2.4 E2抑制TNF-α誘導(dǎo)的IKK磷酸化及其活性
　　用10-8M濃度的E2預(yù)處理大鼠VSMCs24 h，再用TNF-α(100 ng/ml)處理15 min，用Western blot方法分別檢測細(xì)胞內(nèi)磷酸化的IKKα/β/γ。結(jié)果顯示，TNF-α可明顯提高IKKα/β/γ蛋白磷酸化水平，增加率分別為（626.8±13.6）％、(701.6±19.6)％、（539.

12、7±16.9）％。
　　小結(jié):E2通過抑制VSMCs中NF-κB通路，從而抑制TNF-α誘導(dǎo)的TRAIL表達(dá)。
　　第三章 E2通過促進(jìn)NO釋放抑制NF-κB通路
　　在本部分實(shí)驗(yàn)中，為探討E2抑制NF-κB通路的機(jī)制，筆者檢測了雌激素對(duì)于NO釋放的影響以及阻斷NO后對(duì)于NF-κB活性的調(diào)控作用。
　　3.1 不同濃度E2處理VSMCs促進(jìn)NO釋放
　　筆者用不同濃度的E2（10-9M、10-8M、10-7

13、M、10-6M）預(yù)處理大鼠VSMCs24h，測定其對(duì)NO釋放的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度的E2(10-9M、10-8M、10-7M、10-6M)均能促進(jìn)NO釋放，其增加幅度分別為（146.4±9.3）％、(185.2±11.6)％、(165.2±12.8)％、(137.2±10.5)％(n=5,*p＜0.05 vs.CON;**p＜0.01 vs.CON)。
　　3.2 E2呈時(shí)間依賴性促進(jìn)NO釋放
　　筆者用10-8M濃度的

14、E2處理大鼠VSMCs不同時(shí)間(6h、12h、24 h、48 h)后，檢測培養(yǎng)液上清中NO的水平。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，E2處理大鼠VSMCs6 h、12h、24 h、48 h后均可促進(jìn)NO釋放，其增加幅度為（126.4±8.5）％、(165.2±10.4)％、（213.2±15.6)％、（180.2±12.6)％(n=5,*p＜0.05 vs.CON;**p＜0.01 vs.CON)。
　　3.3 NO供體硝普鈉(SNP)

15、抑制TNF-α促TRAIL表達(dá)的效應(yīng)
　　筆者以NO供體SNP(10-4M)預(yù)處理VSMCs1 h后，用10-8M濃度的E2預(yù)處理大鼠VSMCs24 h，再用TNF-α(100 ng/ml)處理24 h，以ELISA方法檢測培養(yǎng)液與細(xì)胞裂解液中TRAIL蛋白表達(dá)濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SNP可顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的TRAIL蛋白表達(dá)，其抑制率為（63.2±6.7）％(n=5，#p＜0.01 vs.TNF-α); E2(10-8M)同樣可

16、以抑制TNF-α對(duì)TRAIL蛋白的上調(diào)作用，其抑制率為（60.1±7.3）％（n=5，#p＜0.01 vs.TNF-α），這一作用與SNP作用并不疊加，表明雌激素主要通過NO途徑抑制TRAIL蛋白表達(dá)。
　　3.4 NO抑制劑L-NMMA抑制E2對(duì)TRAIL表達(dá)的下調(diào)效應(yīng)
　　筆者以NO抑制劑L-NMMA(10-5M)預(yù)處理VSMCs1 h后，用10-8M濃度的E2預(yù)處理大鼠VSMCs24 h，用TNF-α(100 ng/m

17、l)處理24 h，以ELISA方法檢測培養(yǎng)液與細(xì)胞裂解液中TRAIL蛋白表達(dá)濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，L-NMMA對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的TRAIL蛋白表達(dá)沒有影響，但其可顯著抑制E2(10-8M)對(duì)TRAIL蛋白的下調(diào)作用，其抑制率為（58.2±8.8）％（n=5，*p＜0.01 vs.CON）。
　　小結(jié):E2通過促進(jìn)NO釋放，抑制VSMCs中NF-κB通路，從而抑制TNF-α誘導(dǎo)的TRAIL蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.TNF