ROCK亞型在血管平滑肌細(xì)胞遷移和增殖中的作用.pdf

1、目的：血管平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖在動(dòng)脈粥樣硬化、血管術(shù)后再狹窄等心血管疾病中具有重要作用。影響血管平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路很多，其中在RhoA/ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，ROCK通過使其下游的蛋白質(zhì)磷酸化，間接地調(diào)控肌動(dòng)蛋白的聚合和解聚以及與肌球蛋白的相互作用，最終影響細(xì)胞的遷移。研究還發(fā)現(xiàn)ROCK能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)行，從而影響血管平滑肌細(xì)胞的增殖。ROCK有兩種亞型包括ROCK1和ROCK2，兩者

2、的氨基酸序列具有65%的同源性，其中激酶區(qū)的同源性高達(dá)92%。因此，一般認(rèn)為兩者在細(xì)胞內(nèi)的功能相同。然而，近年來研究發(fā)現(xiàn)ROCK1和ROCK2在某些細(xì)胞中具有不同的磷酸化底物和細(xì)胞功能。目前，ROCK的兩種亞型在血管平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖的作用是否相同尚不清楚。本研究旨在研究ROCK亞型（ROCK1和ROCK2）在血管平滑肌細(xì)胞遷移和增殖中的作用及其分子機(jī)制。 方法：（1）利用RNA干擾原理，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染特異性針對ROCK亞型

3、的人工合成的siRNA，使ROCK1和ROCK2表達(dá)分別下調(diào)，觀察ROCK1和ROCK2對PDGF誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞（A7r5）遷移和血清刺激的增殖是否具有相同的作用；（2）使用ROCK的特異抑制劑Y-27632同時(shí)抑制ROCK1和ROCK2的激酶活性，觀察ROCK對細(xì)胞遷移和增殖的影響；（3）用蛋白免疫印跡技術(shù)檢測蛋白的表達(dá)情況；（4）使用Boyden Chamber法觀察ROCK1和ROCK2表達(dá)下調(diào)后對血管平滑肌細(xì)胞遷移的影響；

4、（5）使用MTT法檢測ROCK激酶表達(dá)下調(diào)后血管平滑肌細(xì)胞的生長曲線，并用流式細(xì)胞儀通過PI染色法分析經(jīng)血清饑餓法同步化的細(xì)胞中各細(xì)胞周期時(shí)相的變化。 結(jié)果：（1）ROCK1和ROCK2在血管平滑肌細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平不同，ROCK2的表達(dá)水平是ROCK1的8倍；（2）做細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)時(shí)，通過轉(zhuǎn)染 siRNA使ROCK1和ROCK2的表達(dá)分別下調(diào)83．4%和94．7%；（3）ROCK1表達(dá)下調(diào)后，抑制了血管平滑肌細(xì)胞的遷移，而RO

5、CK2表達(dá)下調(diào)后對細(xì)胞的遷移無明顯影響，ROCK活性被Y-27632抑制后也抑制了細(xì)胞的遷移；（4）ROCK1表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致LIMK的磷酸化水平降低，ROCK2表達(dá)下調(diào)后對LIMK磷酸化水平無明顯影響，Y-27632抑制ROCK活性后LIMK的磷酸化水平也降低；（5）ROCK1表達(dá)下調(diào)后導(dǎo)致MLC磷酸化水平增加，ROCK2表達(dá)下調(diào)后對MLC磷酸化水平無明顯影響，Y-27632抑制ROCK活性也可使MLC磷酸化水平也增加；（6）轉(zhuǎn)染siRN

6、A后，ROCK1和ROCK2兩組之間細(xì)胞的生長無明顯差別，而且細(xì)胞周期G1/S期的轉(zhuǎn)化也無明顯變化，而Y-27632抑制ROCK活性后G1/S期的轉(zhuǎn)化受到抑制。 結(jié)論：（1）在ROCK的兩種亞型中，ROCK1在血管平滑肌細(xì)胞的遷移中起了主導(dǎo)作用，ROCK2對血管平滑肌細(xì)胞的遷移的調(diào)節(jié)作用不明顯；（2）ROCK1通過下調(diào)LIMK的磷酸化，上調(diào)MLC的磷酸化途徑調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞的遷移；（3）ROCK1和ROCK2對血管平滑肌細(xì)胞的