HSP60與血管平滑肌細胞增殖及遷移分子機制的研究.pdf

1、目的:動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是嚴重威脅人類健康的常見疾病和多發(fā)病，它常導致一些致死性的心腦血管方面的疾病，例如腦梗塞、心肌梗死等。動脈粥樣硬化在早期的病理學中被描述為一種終末期退行性疾病，它會導致動脈管腔的廣泛性狹窄，其發(fā)生過程及其復雜，是由多種因素參與的慢性炎癥過程。其中內皮細胞、血管平滑肌細胞和巨噬細胞與動脈粥樣硬化斑塊的形成有著密切的聯(lián)系。
　　 血管平滑肌細胞(Vascularsmoothm

2、usclecell，VSMC)的表型轉化、增殖、遷移是動脈粥樣硬化發(fā)病的關鍵因素。血管平滑肌細胞不同于其它的細胞，當它受到外界損傷時，細胞會降低其特異性伸縮蛋白的表達，進而能促進細胞的增生和遷移。同時，基質金屬蛋白酶的合成也會相應的增加，此過程能促進血管損傷的修復，如果這種修復的過程出現(xiàn)了異常，就會導致如高血壓、動脈粥樣硬化和血管狹窄等血管性的疾病。血管平滑肌細胞表型的變化在血管性疾病形成的過程中起著十分重要的作用。平滑肌細胞的狀態(tài)分為

3、“合成型”和“伸縮型”，這兩種狀態(tài)呈現(xiàn)此消彼長的關系。當細胞呈現(xiàn)“合成型”狀態(tài)時，其保持“伸縮型”狀態(tài)的基因處于被抑制的狀態(tài)，而與增殖遷移相關的一些基因則高表達。這種“合成型”狀態(tài)的細胞能夠分泌相關的基質金屬蛋白酶和相關彈性蛋白，最終導致受損血管的修復和重塑。在動脈粥樣硬化斑塊形成、斑塊破潰的過程中，伴隨著平滑肌細胞的增生。
　　 熱休克蛋白(heatshockprotein，HSP)是生物受到外界不良刺激發(fā)生反應而產生的應激蛋

4、白，存在于原核和真核生物中，可被免疫系統(tǒng)視為外源分子，誘發(fā)自身免疫反應。這種蛋白在細胞增殖、細胞周期及細胞凋亡等細胞活動中發(fā)揮著重要作用。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)了二十多種HSP。它們多以分子量命名，如HSP10、HSP20、HSP27、HSP40、HSP60、HSP70等。一些研究顯示HSP與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程密切相關。如HSP27具有調節(jié)肌動蛋白活性、抗細胞凋亡、抗氧化應激、抗炎等作用。在動脈粥樣硬化斑塊中，能檢測到HSP27基因的表

5、達，由于HSP27與HSP20在結構上具有較高的同源性，因此，HSP20在平滑肌細胞中也能大量表達，對細胞的遷移、肌肉的收縮起到調節(jié)作用，進而參與動脈粥樣硬化的形成。此外，在冠狀動脈粥樣硬化患者中，血清中也會檢測到HSP70的表達。有研究顯示，在兔動脈粥樣硬化模型中，平滑肌細胞的增殖與HSP70基因表達呈正相關。隨著內膜的增厚，HSP70基因表達水平明顯增高。
　　 現(xiàn)有的流行病學、病理學和動物模型的研究資料表明，HSP60與A

6、S的發(fā)生發(fā)展有密切關系。研究顯示在人的動脈粥樣硬化區(qū)域中的細胞內能檢測到內源性HSP60，且病變的程度和HSP60的表達量成正相關。還有研究發(fā)現(xiàn)HSP60可作為一種促炎癥性因子，在心臟病患者和不同程度的冠狀動脈疾病患者的血清中都呈現(xiàn)不同的表達量。血清中HSP60表達水平越高，發(fā)生心血管疾病的可能性就越大。而且HSP60血清表達量越高，與患者病情的嚴重程度呈正相關。已有文獻提示HSP-60致AS的發(fā)生可能主要有兩方面原因:(1)生物受到各

7、種外界刺激后血管壁產生大量的內源性HSP60，它作為一種自身抗原可以激發(fā)局部免疫反應，損傷血管內皮系統(tǒng)，促進AS的發(fā)生發(fā)展;(2)病原感染宿主后，針對病原體產生的外源抗原-抗體復合物沉積于血管壁，進而激活補體，調節(jié)T細胞的功能，誘導血管壁細胞產生細胞因子及粘附因子，促進AS進展。HSP60作為抗原被機體的免疫體通過免疫細胞表面的受體所識別，如TLR樣受體(TLR-2或TLR-4)。許多研究報道TLR樣受體是一種小分子的HSP受體。該類受

8、體能激活NF-κB通路，進而釋放一些促炎性因子。而TLR-4基因的突變和多態(tài)性與動脈粥樣硬化的形成有著密切的關系。
　　 盡管許多研究顯示HSP60與AS發(fā)生發(fā)展關系密切，然而關于HSP60與AS形成的分子機制的研究卻鮮為報道。本研究擬通過HSP60對于大鼠主動脈血管平滑肌細胞(A7r5)增殖和遷移的作用及相關信號通路的研究，以求進一步探尋HSP60與AS形成的分子機制，為AS發(fā)病機制的研究開拓新的領域。
　　 方法:(

9、1)在42℃條件下培養(yǎng)血管平滑機細胞(A7r5)1小時后，再經過37℃培養(yǎng)24h后提取胞漿蛋白，利用Westernblot檢測HSP60的表達量，并與正常37℃培養(yǎng)A7r5細胞提取的蛋白相比較，觀察熱刺激對內源性HSP60表達的影響;(2)BoydenChamber法觀察HSP60對細胞遷移的影響:①通過不同濃度HSP60（1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml）分別刺激VSMC5h和24h，觀察其是

10、否能引起細胞的遷移，并確定最佳誘導細胞遷移濃度;②分別用10μmol/L、20μmol/LU0126（p-ERK抑制劑）預處理細胞1小時，再用10ng/mlHSP60刺激細胞24h，觀察細胞的遷移是否收到抑制;③用TLR4抗體預封閉細胞表面受體1小時，再用10ng/mlHSP60刺激細胞24h，觀察細胞遷移是否收到抑制;(3)劃痕實驗觀察HSP60對細胞遷移的影響:用10ng/ml的HSP60刺激VSMC24h、48h后，在顯微鏡下觀察

11、細胞遷移的情況;(4)MTT方法觀察細胞增殖變化:①檢測不同濃度HSP60(1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml)刺激A7r5細胞24h后，觀察對細胞增殖的調節(jié)作用，確定最佳誘導細胞增殖的濃度;②分別用10μmol/L、20μmol/LU0126預處理細胞1小時，觀察細胞的增殖是否收到抑制;③用TLR4抗體預封閉細胞表面受體1小時，再用10ng/mlHSP60刺激細胞24h，觀察細胞增殖是否收到抑制

12、;(5)利用10ng/mlHSP60刺激VSMC24h后收集細胞，流式細胞術檢測細胞周期的變化;(6)不同濃度HSP60(1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)在不同時間點(10min、30min、45min、1h、2h、4h)分別刺激VSMC后，利用Westernblot檢測p-ERK的表達量，觀察HSP60誘導細胞增殖及遷移的信號通路;(7)利用RealTimePCR方法，檢測HSP60誘導

13、細胞增殖及遷移是否通過細胞表面受體TLR2或TLR4介導的;(8)用TLR4抗體對A7r5細胞預處理1小時，再經10ng/mlHSP60處理細胞24小時，通過Westernblot觀察p-ERK的表達，驗證HSP60誘導細胞增殖及遷移是通過TLR4受體介導的。
　　 結果:(1)經過42℃培養(yǎng)細胞1小時后，提取蛋白與正常37℃培養(yǎng)細胞內的蛋白比較，內源性HSP60表達明顯增高;(2)BoydenChamber結果顯示:①不同濃度

14、HSP60(1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml)刺激VSMC后，均能誘導平滑肌細胞遷移，且細胞的遷移數(shù)量與濃度呈正相關。其中在10ng/ml的濃度，細胞的遷移量最多(P＜0.05)，因此將10ng/ml的濃度確定為最佳誘導濃度;②用10μmol/L及20μmol/L的U0126預處理細胞1小時后，細胞的遷移數(shù)量減少，其中20μmol/L的U0126預處理，細胞遷移數(shù)量明顯減少，表明HSP60誘導V

15、SMC遷移是與ERK信號途徑有關;⑧TLR4抗體預封閉細胞表面受體1小時后，細胞遷移數(shù)量也明顯減少，表明HSP60誘導VSMC遷移與TLR4受體相關;(3)劃痕結果顯示細胞在10ng/mlHSP-60刺激24h、48h后，細胞也有明顯的遷移跡象，以48h最為明顯;(4)MTT方法觀察細胞增殖結果顯示:①不同濃度HSP60（1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml）刺激細胞后，在1ng/ml和5ng/ml

16、HSP60是細胞增殖變化不明顯，當10ng/ml、20ng/mlHSP60刺激時，細胞增殖數(shù)量明顯增加(P＜0.05)，其中以10ng/mlHSP60處理細胞增殖更明顯;②不同濃度10μmol/L、20μmol/L的U0126預處理細胞1小時后，細胞的增殖數(shù)量明顯減少（P＜0.05）;③用TLR4抗體預封閉細胞表面受體1小時，細胞增殖數(shù)量也明顯減少(P＜0.05);(5)10ng/mlHSP60刺激細胞后，流式細胞術檢測細胞周期中的S期

17、明顯升高;(6)不同濃度HSP60(1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)刺激VSMC后，Westemblot檢測p-ERK的表達明顯增加。其中在10ng/mlHSP60濃度時，p-ERK的表達量增加最多;不同時間點(10min、30min、1h、2h、4h)刺激VSMC后，p-ERK的表達量也呈增加的趨勢，在10min時，p-ERK的表達量最多;(7)不同濃度HSP60(1ng/ml、10ng

18、/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)刺激VSMC后，RealTimePCR方法檢測TLR-2和TLR-4受體在mRNA水平表達，結果顯示HSP60能促進TLR-4受體表達，而不影響TLR-2受體表達。在10ng/mlHSP60刺激時，TLR-4的表達量最高;(8)用TLR4抗體封閉后，Westernblot結果顯示其p-ERK的表達量明顯下降。
　　 結論:(1)血管平滑肌細胞(A7r5)在42℃條件下能夠