FAD2基因RNAi及其對(duì)脂肪酸組成的影響.pdf

1、油菜作為一種重要的油料作物，在我國每年生產(chǎn)的食用油中，約占40％左右。油酸是菜籽油的優(yōu)質(zhì)成分，提高油菜品質(zhì)是油菜育種的目標(biāo)之一。油酸不僅在食用方面具有氧化穩(wěn)定性，可長期保存的特點(diǎn)，高油酸植物油在工業(yè)上也有很高的利用價(jià)值。因此，提高油酸含量已成為油菜品質(zhì)改良的重點(diǎn)?；蚬こ碳夹g(shù)已經(jīng)逐漸成為作物種質(zhì)改良中主要的手段之一。 本研究采用RNAi技術(shù)，構(gòu)建具有種子特異性表達(dá)的含fad2反向重復(fù)序列的ihpRNA表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和

2、花粉管通道法轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜。本研究旨在通過RNAi技術(shù)抑制fad2基因在種子發(fā)育期的表達(dá)，達(dá)到降低油菜籽中亞油酸和a亞麻酸的合成，提高油酸含量的目的。主要研究結(jié)果如下： 1.根據(jù)GeneBank序列AF420598設(shè)計(jì)引物，在甘藍(lán)型油菜中PCR克隆Napin啟動(dòng)子，插入ihpRNA中間載體pKANNIBAL中取代原35S啟動(dòng)子，構(gòu)建具有種子特異性表達(dá)啟動(dòng)子的ihpRNA中間載體pKA-N；根據(jù)GeneBank中序列AF24304

3、5設(shè)計(jì)引物，通過RT-PCR在甘藍(lán)型油菜中克隆fad2基因，通過比對(duì)選取約310bp保守區(qū)段，反向重復(fù)插入ihpRNA中間載體pKA-N中，構(gòu)建好完整的ihpRNA中間載體pKA-N-fad2。將中間載體中表達(dá)區(qū)段插入最終表達(dá)載體pGreen0229中，構(gòu)建好最終ihpRNA表達(dá)載體pG-fad2i。 2.構(gòu)建原核表達(dá)載體PET-fad2，對(duì)克隆的fad2基因編碼區(qū)進(jìn)行原核表達(dá)，SDS-PAGE檢測，得到與預(yù)測結(jié)果一致的融合蛋白

4、。 3.通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和花粉管通道法轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜中雙9號(hào)，61077，61078。經(jīng)除草劑篩選獲得抗除草劑植株30株。其中獲得10株雙9號(hào)，16株61077，4株61078。 4.PCR檢測表明轉(zhuǎn)基因植株假陽性率為50％左右。 5.對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的種子進(jìn)行分析，分析脂肪酸組成變化：甘藍(lán)型油菜中雙9號(hào)油酸含量平均提高約7％，亞油酸含量平均降低約6％，亞麻酸含量平均降低約1％；甘藍(lán)型油菜61077油酸含量平均提高約