花生脂肪酸品質(zhì)改良關(guān)鍵基因FAD2的克隆與特異表達(dá)載體構(gòu)建.pdf

1、花生是世界第四大油料種子作物，在全世界范圍內(nèi)的熱帶和亞熱帶地區(qū)種植。中國(guó)是世界上生產(chǎn)花生最多的國(guó)家之一。決定食用植物油品質(zhì)的一個(gè)主要因素是脂肪酸的構(gòu)成。花生油主要含有油酸和亞油酸，油酸能降低人體內(nèi)低密度脂蛋白膽固醇(LDL)含量，同時(shí)并不會(huì)降低高密度脂蛋白膽固醇(HDL)；而含亞油酸和亞麻酸等多不飽和脂肪酸高的植物油會(huì)同時(shí)降低LDL、HDL?，F(xiàn)有的品種中油酸與亞油酸的比值偏低，因此提高花生油中油酸的含量已成為世界花生品質(zhì)改良的主要方向。

2、為了改良花生的油酸組成，本研究采用了分子生物學(xué)、生物信息學(xué)技術(shù)和基因工程手段研究了花生的油酸改良。通過(guò)同源克隆途徑分別克隆了油酸脫氫酶基因的編碼區(qū)及片段，同時(shí)克隆了胚特異表達(dá)啟動(dòng)子，通過(guò)酶切和連接構(gòu)建了胚特異表達(dá)FAD2的反義RNA植物表達(dá)載體和RNAi的中間表達(dá)載體；并通過(guò)凍融法將植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，并用于遺傳轉(zhuǎn)化研究。其主要結(jié)果如下： 1.為了使目的基因在花生胚中特異表達(dá)，根據(jù)網(wǎng)上已發(fā)表的序列信息合成引物，分別利用PCR

3、技術(shù)從大豆中分離得到油體蛋白基因oleosin的啟動(dòng)子和β-伴球蛋白α亞基的啟動(dòng)子(7S)，；從油菜中分離得到油菜1.7Snapin種子貯藏蛋白(napA)基因的啟動(dòng)子(2S)；從胡蘿卜中分離得到胡蘿卜Lea族基因Dc3的啟動(dòng)子(Dc3)。將7S、2S和Dc3啟動(dòng)子構(gòu)建到克隆載體pGM-T中，并進(jìn)行測(cè)序，oleosin啟動(dòng)子構(gòu)建到中間表達(dá)載體pSPROK中，并進(jìn)行了測(cè)序鑒定。測(cè)定結(jié)果表明：7S啟動(dòng)子的長(zhǎng)度為878bp，與GenBank上

4、引用的序列的同源性為99.8％；2S啟動(dòng)子的長(zhǎng)度為1145bp，與GenBank上引用的序列的同源性為100％;Dc3啟動(dòng)子的長(zhǎng)度為153bp，與GenBank上引用的序列的長(zhǎng)度為100％;啟動(dòng)子oleosin-a與oleosin-b的長(zhǎng)度分別為595bp和319bp，與GenBank上引用的序列的同源性為分別為97％和96％。 2.從花生中提取基因組DNA，根據(jù)GenBank上發(fā)表的△12脂肪酸脫氫酶基因的序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，利用

5、PCR技術(shù)從花生葉片中分離得到了兩個(gè)不同長(zhǎng)度的目的片段：FAD2-1和FAD2-2，然后與大豆油體蛋白基因oleosin的啟動(dòng)子相連，先構(gòu)建在pSPROK中間表達(dá)載體上，進(jìn)而構(gòu)建到植物表達(dá)載體pCAMBIA1300中，已得到三個(gè)反義RNA表達(dá)載體，分別命名為pCAMBIA1300-2a、pCAMBIA1300-2b和pCAMBIA1300-1a。測(cè)序表明，F(xiàn)AD2-2已經(jīng)插入到植物表達(dá)載體pCAMBIA1300中，該片段長(zhǎng)度為593bp

6、，含有一個(gè)558bp的編碼區(qū)，編碼186個(gè)氨基酸，與已報(bào)道的序列具有97％的同源性；FAD2-1已經(jīng)插入到植物表達(dá)載體pCAMBIA1300中，該片段長(zhǎng)度為1175bp，含有一個(gè)1140bp的編碼區(qū)，編碼380個(gè)氨基酸，與已報(bào)道的序列具有99％的同源性；目前這三個(gè)表達(dá)載體已轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，并對(duì)花生進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化研究。 3.分別從花生葉片中分離得到了△12脂肪酸脫氫酶基因的四個(gè)目的片段，長(zhǎng)度為200bp和400bp。構(gòu)建