花色苷對脂肪細胞脂肪酸代謝的影響及其機制探討.pdf

1、本次研究擬在前期對花色苷生物學作用研究的基礎上，采用大鼠成熟原代脂肪細胞為模型，選用花色苷中常見的矢車菊素-3-葡萄糖苷作為受試物，觀察花色苷在體外對大鼠原代脂肪細胞AMPK活化、脂肪酸氧化和甘油三酯含量的影響，以及在體內(nèi)對AMPK以及其下游酶類活化的影響，明確花色苷是否能夠通過AMPK信號通路調(diào)節(jié)脂肪積聚。
　　 研究目的：
　　 1觀察花色苷在體外對原代脂肪細胞脂肪酸氧化和甘油三酯含量的影響，探討AMPK信號通路調(diào)節(jié)

2、脂肪積聚的機制；
　　 2觀察花色苷在體內(nèi)對脂肪細胞的作用，探討與AMPK通路的相關機制，以及花色苷的抗肥胖作用，為營養(yǎng)膳食防治肥胖提供理論依據(jù)。
　　 研究方法：
　　 1.細胞實驗
　　 1.1.大鼠原代成熟脂肪細胞模型的建立
　　 SD大鼠斷頭處死，浸于75％酒精中消毒。
　　 大鼠成熟脂肪細胞的鑒定：進行油紅O-蘇木精染色后顯微鏡下觀察，細胞內(nèi)有大量脂滴存在，呈紅色，細胞核呈藍色，

3、符合脂肪細胞形態(tài)特點。
　　 1.2.細胞培養(yǎng)及分組
　　 取出的大鼠成熟原代脂肪細胞分別用1μM、10μM、100μM Cy-3-g處理1h；用不加任何干預的細胞作為對照(control)，用1mM的AMPK激動劑AICAR作為陽性對照。
　　 1.3.花色苷Cy-3-g對大鼠脂肪細胞甘油三酯(Triglyceride，TG)含量的影響
　　 將大鼠原代脂肪細胞分別與1μM、10μM、100μM Cy-

4、3-g和1mM AICAR孵育1h后，收集細胞用試劑盒檢測。
　　 1.4.花色苷Cy-3-g對大鼠脂肪細胞脂肪酸氧化(fatty acid oxidation，F(xiàn)AO)的影響
　　 將脂肪細胞在無血清DMEM培養(yǎng)基中饑餓6～8h，用1μM、10μM、100μM的花色苷干預1h，每孔加入3H-棕櫚酸2μCi/mL、L-卡尼丁(L-camitine)1mmol/L，孵育后吸棄培養(yǎng)基，測定3H2O放射性。
　　 1.

5、5花色苷Cy-3-g對大鼠脂肪細胞CPT-Ⅰ水平和ACC磷酸化的影響
　　 將脂肪細胞饑餓6～8h后，分別與1μM、10μM、100μM Cy-3-g和1mMAICAR孵育1h，收集細胞總蛋白用于免疫印跡檢測。
　　 1.6花色苷Cy-3-g對大鼠脂肪細胞內(nèi)AMPK活性的影響
　　 將饑餓后的脂肪細胞分別與1μM、10μM、100μM Cy-3-g和1mM AICAR孵育1h后，收集細胞，用AMPK試劑盒檢測AM

6、PK活性。
　　 1.7花色苷Cy-3-g對大鼠脂肪細胞內(nèi)AMPK及其磷酸化水平的影響
　　 將饑餓后的脂肪細胞分別與1μM、10μM、100μM Cy-3-g和1mM AICAR孵育1h后，收集細胞總蛋白用于免疫印記檢測。
　　 2.動物實驗
　　 2.1 Kkay小鼠的喂養(yǎng)
　　 在自然光照(08：00到20：00)和23±3℃的條件下喂養(yǎng)Kkay小鼠。把5周齡的Kkay小鼠隨機分為2組，每組

7、6只小鼠。其中1組用添加花色苷Cy-3-g(1g/kg)的飼料喂養(yǎng)，另外一組用標準飼料喂養(yǎng)。
　　 2.2花色苷對Kkay小鼠體重、攝食量和腹部脂肪的影響
　　 喂養(yǎng)8周后，處死小鼠，取腹部脂肪組織，稱量重量。稱量Kkay小鼠的5周齡時的開始體重與花色苷喂養(yǎng)8周后的終體重，并計算出8周內(nèi)Kkay小鼠的攝食量。
　　 2.3花色苷Cy-3-g對小鼠腹部脂肪組織內(nèi)CPT-Ⅰ水平和ACC磷酸化的影響
　　 取花

8、色甘組和對照組Kkay小鼠的腹部脂肪組織，裂解組織后，收集細胞總蛋白用于免疫印跡檢測。
　　 2.4花色苷Cy-3-g對小鼠腹部脂肪組織內(nèi)AMPK活性的影響
　　 取花色甘組和對照組Kkay小鼠的腹部脂肪組織，裂解組織后，收集組織中總蛋白用于AMPK活性的檢測。
　　 2.5花色苷Cy-3-g對大鼠脂肪細胞內(nèi)AMPK及其磷酸化水平的影響
　　 取花色甘組和對照組Kkay小鼠的腹部脂肪組織，裂解組織后，收集

9、細胞總蛋白用于免疫印跡檢測。
　　 2.6花色苷Cy-3-g對小鼠腹部脂肪組織形態(tài)的影響
　　 8周后處死花色苷組和對照組的Kkay小鼠，取腹部脂肪組織，進行石蠟切片HE染色。
　　 研究結(jié)果：
　　 1細胞實驗
　　 1.1花色苷對大鼠脂肪細胞甘油三酯含量的影響
　　 與對照組相比，1μM、10μM、100μM Cy-3-g能顯著減少脂肪細胞內(nèi)的甘油三酯含量(p＜0.001)，甘油三酯含

10、量分別減少了27.9％、30.5％、45.7％，呈明顯的劑量-效應關系。與AMPK激動劑AICAR相比，分別相當于1mMAICAR處理組的39.4％、43.0％和64.5％。
　　 1.2花色苷對大鼠脂肪細胞脂肪酸氧化的影響
　　 與對照組相比，100μM Cy-3-g能顯著促進脂肪細胞脂肪酸氧化(p＜0.001)，而1μM、10μM Cy-3-g在促進脂肪細胞脂肪酸氧化上沒有統(tǒng)計學意義。Cy-3-g濃度從低到高其脂肪酸

11、氧化水平分別為對照組的1.42、1.44、2.15倍。AMPK激動劑1mMAICAR處理組為對照組的2.48倍。與AICAR相比，分別相當于1mMAICAR處理組的56.7％、58.1％和86.8％。
　　 1.3花色苷對大鼠脂肪細胞CPT-Ⅰ蛋白表達的影響
　　 與對照組相比，10μM、100μM Cy-3-g能顯著促進脂肪細胞內(nèi)CPT-Ⅰ蛋白的表達水平(p＜0.01)，CPT-Ⅰ蛋白表達水平分別為對照組的2.1倍和2

12、.3倍，呈明顯的劑量-效應關系。1μM的Cy-3-g處理組CPT-Ⅰ蛋白表達水平為對照組的1.5倍，沒有統(tǒng)計學意義。與AMPK激動劑AICAR相比，相當于1mM AICAR處理組的53.5％、76.2％和84.5％。
　　 1.4花色苷對大鼠脂肪細胞ACC磷酸化的影響
　　 與對照組相比，1μM、10μM、100μM Cy-3-g能顯著促進脂肪細胞內(nèi)ACC的磷酸化(p＜0.001)，ACC磷酸化分別為對照組的1.3、1.

13、5和1.6倍，呈明顯的劑量-效應關系。與AMPK激動劑AICAR相比，相當于1mMAICAR處理組的69.0％、80.5％和85.3％。
　　 1.5花色苷對大鼠脂肪細胞AMPK活化的影響
　　 與對照組相比，1μM、10μM、100μM Cy-3-g能顯著促進脂肪細胞內(nèi)AMPK的活性(p＜0.001)，AMPK蛋白活性分別為對照組的1.35、1.39和1.49倍，呈明顯的劑量-效應關系。與AMPK激動劑AICAR相比，

14、相當于1mM AICAR處理組的72.5％、77.3％和82.6％。
　　 1.6花色苷對大鼠脂肪細胞AMPK磷酸化的影響
　　 與對照組相比，1μM、10μM、100μM Cy-3-g能使顯著促進脂肪細胞內(nèi)AMPK蛋白磷酸化(p＜0.001)，AMPK蛋白磷酸化水平分別為對照組的2.2、2.6和2.7倍，呈明顯的劑量-效應關系。與AMPK激動劑AICAR相比，相當于1mMAICAR處理組的71.2％、83.9％和88.

15、5％。
　　 1.7花色苷對大鼠脂肪細胞AMPK蛋白的影響
　　 與對照組相比，1μM、10μM、100μM Cy-3-g和1mM AICAR對AMPK蛋白表達水平無影響(p＞0.05)。
　　 2動物實驗
　　 2.1花色苷對Kkay小鼠體重、攝食量和腹部脂肪的影響
　　 花色苷喂養(yǎng)的Kkay小鼠和對照組相比，體重、攝食量以及腹部脂肪組織重量都沒有明顯差異(p＞0.05)，沒有統(tǒng)計學意義。

16、>　　 2.2花色苷對小鼠腹部脂肪組織內(nèi)AMPK活化的影響
　　 與一般飼料喂養(yǎng)的對照組相比，花色苷喂養(yǎng)組小鼠的組織中AMPK的活性明顯升高(p＜0.001)，AMPK的活性為對照組的3.8倍，有明顯統(tǒng)計學意義。
　　 2.3花色苷對小鼠腹部脂肪組織內(nèi)AMPK磷酸化的影響
　　 與一般飼料喂養(yǎng)的對照組相比，花色苷喂養(yǎng)組小鼠的組織中AMPK磷酸的水平明顯升高(p＜0.001)，AMPK蛋白磷酸化水平為對照組的6.

17、2倍，有明顯統(tǒng)計學意義。
　　 2.4花色苷對小鼠腹部脂肪組織內(nèi)AMPK蛋白表達的影響
　　 與一般飼料喂養(yǎng)的對照組相比，花色苷喂養(yǎng)組小鼠的組織中AMPK表達水平?jīng)]有明顯變化(p＞0.05)，沒有統(tǒng)計學意義。
　　 2.5花色苷對小鼠腹部脂肪組織內(nèi)ACC磷酸化的影響
　　 與一般飼料喂養(yǎng)的對照組相比，花色苷喂養(yǎng)組小鼠的組織中ACC磷酸的水平明顯升高(p＜0.001)，ACC蛋白磷酸化水平為對照組的4.4倍

18、，有統(tǒng)計學意義。
　　 2.6花色苷對小鼠腹部脂肪組織內(nèi)CPT-Ⅰ蛋白表達的影響
　　 與一般飼料喂養(yǎng)的對照組相比，花色苷喂養(yǎng)組小鼠的組織中CPT-1的表達水平明顯升高(p＜0.001)，CPT-1蛋白的表達水平為對照組的4.1倍，有明顯統(tǒng)計學意義。
　　 2.7花色苷對小鼠腹部脂肪組織形態(tài)的影響
　　 在顯微鏡下可見，與花色苷喂養(yǎng)組相比較，一般飼料喂養(yǎng)的對照組的腹部脂肪細胞明顯肥大?；ㄉ瘴桂B(yǎng)的Kkay