豬圓環(huán)病毒病-乙型腦炎-細(xì)小病毒病三聯(lián)滅活疫苗的研制及其在試驗(yàn)動(dòng)物模型上的免疫原性評(píng)價(jià).pdf

1、豬圓環(huán)病毒病、豬乙型腦炎和豬細(xì)小病毒病均能引起豬的繁殖障礙，且目前多表現(xiàn)為混合感染或繼發(fā)感染，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。疫苗免疫接種是防控這三種傳染病的主要和有效措施，但市場(chǎng)上僅有商品化單苗。隨著規(guī)?；B(yǎng)殖的發(fā)展，豬場(chǎng)免疫接種工作量的加大，使用單苗進(jìn)行免疫費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，而且對(duì)動(dòng)物造成很大應(yīng)激，影響免疫效果。因此，現(xiàn)代規(guī)?；B(yǎng)殖生產(chǎn)中，迫切需要能夠簡(jiǎn)化免疫程序，一針多防的聯(lián)苗。本研究以研制豬圓環(huán)病毒病-乙型腦炎-細(xì)小病毒病三聯(lián)滅活疫苗為

2、目標(biāo)，完成了以下研究工作:
　　一.建立了基于PCV2 Cap蛋白的間接ELISA方法。用PCR方法獲得截短的豬圓環(huán)病毒2型orf2基因，經(jīng)酶切后克隆至原核表達(dá)載體pET28a后，在終濃度為40μMIPTG，30℃下誘導(dǎo)表達(dá)3h后，經(jīng)SDS-PAGE分析，目的基因得到正確表達(dá)，大小約為24 KDa左右，表達(dá)產(chǎn)物以可溶性表達(dá)為主;Western bloting檢測(cè)證實(shí)其具有免疫反應(yīng)活性。以純化的Cap蛋白為包被抗原，建立了檢測(cè)PCV

3、2抗體的間接ELISA方法。建立的ELISA方法的最佳反應(yīng)條件是:抗原最適包被量為2μg/孔，包被時(shí)間為37℃包被1h后4℃過(guò)夜;血清工作濃度為1∶200，作用時(shí)間為1h;二抗選用HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG，稀釋度為1∶2000，作用時(shí)間為1h;顯色液TMB作用時(shí)間為15 min;判定標(biāo)準(zhǔn)為，樣品OD450值大于或等于0.211判定為陽(yáng)性，小于0.211判定為陰性。所建ELISA方法具有良好特異性，重復(fù)性和準(zhǔn)確性。對(duì)120份疑似豬PCV2

4、血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，該方法與PCV2商品化試劑盒檢測(cè)結(jié)果有較高的符合率。本研究所建立間接ELISA方法可用于PCV2抗體檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。
　　二.制備了豬圓環(huán)病毒病-乙型腦炎-細(xì)小病毒病三聯(lián)滅活疫苗并在試驗(yàn)動(dòng)物模型上對(duì)其免疫原性進(jìn)行研究。利用分離鑒定的豬圓環(huán)病毒2型XX株、豬乙型腦炎病毒XX株與豬細(xì)小病毒XX株，制備三聯(lián)滅活疫苗及相應(yīng)的單苗和二聯(lián)苗。對(duì)制備的疫苗進(jìn)行物理性狀、無(wú)菌檢驗(yàn)和安全檢驗(yàn)后，免疫昆明鼠和BALB/

5、c小鼠，進(jìn)行抗體持續(xù)期試驗(yàn)，肌內(nèi)免疫和皮下免疫的免疫效果對(duì)比試驗(yàn)以及攻毒保護(hù)試驗(yàn);免疫豚鼠，進(jìn)行免疫原性試驗(yàn)及肌內(nèi)免疫和皮下免疫的免疫效果對(duì)比試驗(yàn)。結(jié)果顯示:試制三聯(lián)滅活苗在免疫昆明鼠后，誘導(dǎo)的乙型腦炎病毒抗體在首免后八周達(dá)到高峰，峰值要優(yōu)于相應(yīng)單苗、二聯(lián)苗和商品苗;三聯(lián)苗免疫BALB/c小鼠后，誘導(dǎo)產(chǎn)生的PCV2抗體在首免后六周達(dá)到高峰，且抗體水平要高于相應(yīng)單苗;三聯(lián)苗免疫豚鼠后，誘導(dǎo)產(chǎn)生的豬細(xì)小病毒抗體在首免后四周已具有保護(hù)力，在首